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Anteil an:

2 × Universal Blue SYBR GREE QPCR Master Mix mit 40 × gelbem Vorlagenverdünnungspuffer

Verfügbarkeitsstatus:
  • G3326-01.

Produktbeschreibung

Produkteinführung:

Dieses Produkt ist eine 2x Premix-Lösung für qPCR mit SYBR Green I chimären Fluoreszenzverfahren. Die Kernkomponente, Taq DNA Polymerase, eine wärmeaktivierte DNA-Polymerase durch Antikörperverfahren blockiert, die effektiv nicht-spezifische Amplifikation unter niedrigeren Temperaturbedingungen hemmen können. Inzwischen mit der Reaktion kombiniert Puffer für qPCR optimiert, Taq-DNA-Polymerase ist sehr geeignet für hohe Spezifität und Sensitivität qPCR Reaktion. Eine gute Standardkurve kann in einem weiten Bereich quantitative erhalten werden, die für die quantitative Analyse von Zielgen genau, reproduzierbar und zuverlässig ist. Zugleich enthält dieses Produkt einen besonderen ROX Passive Referenzfarbstoff, die für den Einsatz in allen qPCR Instrumente geeignet ist, und es gibt keine Notwendigkeit, die ROX Konzentration auf verschiedenen Instrumenten anzupassen. Blauer Farbstoff wird in der Vormischung zugegeben, die die Tracer Wirkung der Zugabe von Proben aufweisen, und gelbe Schablone Verdünnungsmittel wird zur gleichen Zeit zur Verfügung gestellt. Wenn die Vorlage mit gelber Vorlage Verdünnungsmittel und hinzugefügt in die blauen Reaktions Vormischung verdünnt wird, zu grün wechselt die Farbe von Blau, die eine Tracer Rolle bei der Herstellung von Reaktionssystemprozess spielen können und verhindern, dass Leckage oder misaddition. Die Spektren der blauen und gelben Farbstoffe nicht überlappen mit den qPCR-Farbstoffe und keine Auswirkungen auf die Reaktionsergebnisse.

Packungsinhalt:

Katze. Nein.

Produktbeschreibung

Volumen

G3326-1

2x Universal-Blau SYBRGreen qPCR Master Mix

1 ml / 5x1mL / 15x1mL

G3326-2

40x Gelb Template Verdünnungspuffer

1ml

Speicherbedingung:

Nasser Eisbeuteltransport; Bei -20 ℃ Temperatur gelagert, gültig für 12 Monate.

Verwendungszweck:

1. (Optional) Vorlagenverdünnungs

Dieses Kit enthält einen 40x YELLOW Template Verdünnungspuffer, eine 40-fache Verdünnung verdünnt Yellow Template, die genau verwendet werden können, um zu bestimmen, ob die Vorlage auf die qPCR Reaktionsflüssigkeit hinzugefügt wurde, indem die Farbe der Flüssigkeit zu verändern. Nimmt man das 20 ul qPCR Reaktionssystem als ein Beispiel, nach der Verdünnungsvorlage Menge zugesetzt in die 20 ul qPCR Reaktionslösung kann die entsprechende Verdünnungsmethode der ursprünglichen Vorlage auf die folgende Tabelle Bezug genommen werden (die ursprüngliche Vorlage 100 ul als Beispiel verdünnt Einnahme ):

Fügen Sie die verdünnte Vorlage zur 20ul QPCR-Reaktionslösung (UL) hinzu

1

2

3

4

5

6

7

8

Fügen Sie den 40X-Gelb-Templat-Verdünnungspuffer an die hinzu100UL-Vorlagenverdünnungssystem(ul)

50

25

16.7

12.5

10

8.4

7.2

6.3

Fügen Sie das 100UL-Vorlagenverdünnungssystem zur Primärvorlage (UL) hinzu

x

x

x

x

x

x

x

x

Volumen des Zugabe von Nuklease - freies Wasser (ul)

50-x.

75-x.

83.3-x.

87,5-x.

90-x.

91,6-x.

92.8-x.

93.7-x.

BEISPIEL: Die 2UL-verdünnte Vorlage sollte dem 20-ul-QPCR-Reaktionssystem hinzugefügt werden. Nehmen Sie das 100-ul-Templat-Verdünnungssystem als Beispiel, wenn das ursprüngliche Vorlagenvolumen 20UL, 25UL 40x gelb Templat-Verdünnungspuffer, zugegeben wird, und dann wird dem Gesamtvolumen von 100UL Nuclease-freiem Wasser 55UL zugesetzt. Der 40x gelbe Vorlagenverdünnungspuffer ist jetzt 10x. Fügen Sie 2UL der verdünnten Template in einen 20-M-Verdünnungs-Verdünnungspuffer hinzu, und der endgültige 40 × gelbe Vorlagenverdünnungspuffer ist 1x. Zusammenfassend sollte der gelbe Vorlagenverdünnungspuffer 1x im endgültigen QPR-System sein.

HINWEIS: Wenn die Vorlage nicht verdünnt werden muss, oder wenn das Vorlagenverdünnungsmittel von G3362-2 nicht verwendet wird, können Sie diesen Schritt ignorieren.

2. Empfehlen Sie das QPRCR-Reaktionssystem:

Komponente

20UL RXN.

50ul rxn.

Endkonzentration

2 × Universal Blue Sybr Green QPCR Master Mix

10.

25UL.

1 ×

Vorwärtsprimer (10äh) A.

0,4UL.

1ul.

0,2.

Reverse Primer (10UM) A

0,4UL.

1ul.

0,2.

TemplateB.

Variable

Variable

nach Bedarf

Nuklease-freies Wasser

Auf 20ULL

In den letzten 50UL.


A. Üblicherweise kann ein guter Verstärkungseffekt mit der Endkonzentration von 0,2 um erhalten werden. Wenn die Reaktionsleistung schlecht ist, kann die Primerkonzentration im Bereich von 0,2-1,0 um eingestellt werden.

B. Die Menge an Vorlagedosierung variiert mit der Kopierzahl des Zielgens in der Vorlagenlösung, und der geeignete Betrag der Vorlagenzugabe wird durch Gradientenverdünnung diskutiert. Die beste Zusatzmenge der Templat-DNA im 20ul-Reaktionssystem betrug weniger als 100 ng. Wenn die cDNA (RT-Reaktionslösung) der RT-PCR-Reaktion als Vorlage verwendet wurde, sollte der Zugabemengbetrag 10% des Gesamtvolumens der PCR-Reaktionslösung nicht überschreiten.

3. PCR-Reaktionsverfahren (kann gemäß den Instrumenten eingestellt werden):

A.Zwei Schritte-Methode.

B. Drei Schritte-Methode

Bühne

Schritt

Zyklusnummer

Temperatur

Time

Bühne

Schritt

Zyklusnummer

Temperatur

Time

Bühne 1

Präggeneration.

1

95 ℃.

30 Sekunden

Bühne 1

Präggeneration.

1

95 ℃.

30 Sekunden

Stufe 2

Degeneration

40

95 ℃.

15 Sek

Stufe 2

Degeneration

40

95 ℃.

15 Sek

Glühverlängerung

60 ℃

30secͣ.

Glühen

55-65 ℃.

10 Sek




Verlängerung

72 ℃.

30 Sekunden

Stufe 3.

Schmelzkurve

1

Instrumenteneinstellungen

Stufe 3.

Schmelzkurve

1

Instrumenteneinstellungen

A: Wenn die Amplifikationsspezifität verbessert werden muss, können zweistufige Prozedur- oder Glühtemperatur verwendet werden. Um die Verstärkungswirksamkeit zu verbessern, kann ein dreistufiger Verfahren oder eine Verlängerungszeit verwendet werden.

Anmerkungen:

1. Wenn die Pipettierverfolgung nicht erforderlich ist, verwenden Sie keinen 40X-Gelb-Templat-Verdünnungspuffer für die Vorlagenverdünnung.

2. Mischen Sie es vor der Verwendung des Reagens, mischen Sie es sanft auf und ab, strudeln Sie nicht und oszillieren Sie, um Blasen zu vermeiden.

3. Wenn Sie die Reaktionslösung vorbereiten, legen Sie das Reagenz auf Eis ein.

4. Dieses Produkt enthält fluoreszierende Färbung SYBR grün, und bei der Vorbereitung der PCR-Reaktionslösung sollte ein starkes Licht vermieden werden.

5. Bitte verwenden Sie eine neue wegwerfbare Pipettenspitze für die Herstellung und Wiederverpackung der Reaktionsflüssigkeit, um eine Kreuzkontamination zwischen den Proben so weit wie möglich zu vermeiden.

6. Vermeiden Sie den wiederholten Freeze-Thaw-Master-Mix, versuchen Sie, es innerhalb eines Monats nach dem Auftauen zu verwenden.

Kompatibilität:

ABI: 5700, 7000, 7300, 7700, 7900, 7900Ht, 7900 HT Fast, Stepone ™, Stepone Plus ™, 7500/7500 FAST, VIIA 7 ™, Quantstudio ™ -Serie, PikoreAltm Cycler;

Stratagene: MX3000P®, 3005P ™, 4000 ™;

Bio-Rad: CFX96 ™, CFX384 ™, ICYCLER IQ ™, IQ5 ™, MYIQ ™, MiniOpticon ™, Opticon®, Opticon 2, Chromo4 ™;

Eppendorf: Realplex 2S, Mastercycler® EP, Realplex;

IIIUMINA: ECO QPR;

Cepheid: smartcycler®;

QIAGEN CORBETT: ROTOR-GEN®-Serie;

Roche: LightCycler ™ -Serie;

Takara: Thermische Zykler-Würfel-Serie;

Analytikjena: QTower-Serie;

QTower: LineGene-Serie.

Primer-Design-Prinzipien:

1. Die Länge des Amplifikationsprodukts wird empfohlen, zwischen 80-300 bp zu liegen;

2. Grundierlänge: 18-25 BP;

3. Der Inhalt der Basis G + C in Primer sollte zwischen 40% -60% liegen;

4. Die TM-Wertdifferenz zwischen Vorwärtsprimern und Reverse-Primern beträgt weniger als 2 ℃, und der TM-Wert zwischen 58-62 ℃ ist das Beste;

5. Zufälligkeit der Basisverteilung;

6. Primer hatten bessere selbstkomplementäre Sequenzen, ansonsten bilden sie eine sekundäre Haarnadelstruktur;

7. Es sollte nicht mehr als 4 komplementäre oder homologe Basen zwischen zwei Primern bestehen, andernfalls wird Primer Dimer gebildet, insbesondere komplementärer Überlappung am 3'-Ende;

8. Die 3'-Anschlussbasis des Primers wird vorgeschlagen, G oder C zu sein;

9. In den NCBI-Vergleichsergebnissen wurden keine anderen nicht spezifischen Produkte gefunden.

Häufige Probleme und Lösungen:

Problembeschreibung

Mögliche Gründe

Lösungen

Am Ende der Reaktion erschien keine Verstärkungskurve oder der CT-Wert schien zu spät zu spät

Die Template-Konzentration ist zu niedrig

Wiederholen Sie das Experiment, um die Vorlagenverdünnung mehrerer zu reduzieren, und beginnen Sie mit der höchsten Konzentration, wenn die Probenkonzentration unbekannt ist

Template-Abbau

Die Vorlage wurde wieder vorbereitet und das Experiment wurde wiederholt


Es gibt PCR-Inhibitoren im System

Im Allgemeinen wird die Schablone eingeführt, das Verdünnungsverhältnis der Vorlage wird erhöht oder die Schablone mit hoher Reinheit ist neu vorbereitet und wiederholt


Primer können degradieren

Primer, die seit langem nicht verwendet wurden, sollten zunächst auf Integrität durch die Seitenelektrophorese getestet werden, um die Möglichkeit der Verschlechterung auszuschließen


Niedrige Amplifikationseffizienz.

Wiederholen Sie die Primer-Konzentration, versuchen Sie es mit einem dreistufigen Verstärkungsverfahren oder umgestalten Sie den Primer


Das Amplifikationsprodukt ist zu lang

Die Amplifikationsproduktlänge wurde im Bereich von 80-300 bp gesteuert


Die leere Steuerung zeigt das Signal an

Reaktionssystemverschmutzung

Erstens sollte das leere Steuerungswasser ersetzt werden. Wenn dieselbe Situation noch auftritt, sollten die Primer, Aspiratoren und PCR-Röhrchen ersetzt werden oder ein neuer Master-Mix sollte gestartet werden. Das Reaktionssystem wird in einem super sauberen Tisch hergestellt, um die Aerosolverschmutzung zu reduzieren

Nichtspezifische Verstärkung wie Primer Dimers erscheint

Im Allgemeinen ist es normal, dass die Amplifikationsprodukte nach 35 Zyklen in der leeren Steuerung auftreten, die mit der Schmelzkurve analysiert werden sollten.

Primer mit Neugestaltung, PRIMER-Konzentration anpassen oder die PCR-Reaktionsverfahren optimieren


Die Schmelzkurve hat mehrere Gipfel

Primer-Design ist schlecht

Der neue Primer wurde nach den Primer-Design-Prinzipien neu gestaltet

Primer-Konzentration ist zu hoch

Primerkonzentration angemessen reduzieren


Es gibt genomische Kontamination in der cDNA-Vorlage

Die extrahierte RNA-Lösung wird mit DNA-Enzymen wie DSDNase verdaut, um genomische Kontamination zu entfernen, oder um Transintron-Primer zu gestalten


Schlechte Reproduzierbarkeit von Experimenten

Der Fehler des Hinzufügens von Probe ist groß

Die Verwendung einer genauen Pipette, mit hochwertiger Saugkopf genaue Pipette;

Hohe Verdünnungsvorlage, das Hinzufügen großer Volume-Vorlage zum Reduzieren des Abtastfehlers;

Das Reaktionsvolumen von QPR wurde vergrößert

Die Template-Konzentration ist zu niedrig

Wiederholen Sie das Experiment, um die Verdünnungszeiten der Vorlage zu reduzieren


Temperaturabweichung an verschiedenen Orten des QPR-Instruments

Kalibrieren Sie das QPCR-Instrument regelmäßig


Die Amplifikationskurve ist nicht glatt

Das Fluoreszenzsignal ist zu schwach, nach der Systemkorrektur hergestellt

Stellen Sie sicher, dass die in der Master-Mischung vorgemischten Farbstoffe nicht beeinträchtigt werden;

Ersetzen Sie das fluoreszierende Signal, um bessere QPR-Verbrauchsmaterialien zu sammeln

Amplifikationskurve bricht oder rutscht

Die Template-Konzentration war höher und der Basis-Endpunktwert war größer als der CT-Wert

Der Baseleline-Endpunkt (CT-Wert -3) wurde reduziert und die Daten wurden erneut analysiert

Amplifikationskurven von einzelnen Brunnen fallen plötzlich scharf ab

Es gibt Blasen im Reaktionsrohr

Stellen Sie sicher, dass die Mischung vollständig gelöst ist, und nicht gleichmäßig aufeinander strudeln und oszillieren;

Nachdem die Probe hinzugefügt wird, werden die Blasen durch Zentrifugation mit Lichtelastisch entfernt.

Die Vor-Denaturierungszeit wurde auf 10 Minuten verlängert, um die Blasen zu entfernen

G3326-01A.Scheibe 11.Scheibe 13.Scheibe 10Scheibe 12.downloadimg.


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