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Annexin V-EGFP / PI-Zell-Apoptose-Erkennungskit für die Durchflusszytometrie- oder Fluoreszenzmikroskopie

Volumen: 50t.

Verfügbarkeitsstatus:
  • G1510-50T.
  • Servicebio

Produktbeschreibung

Produktinformation:

Produktname

Katze. Nein.

Volumen

Annexin V-EGFP / PI-Zell-Apoptose-Erkennungskit

G1510-50T.

50t.

G1510-100T.

100t Jahre

Produktbeschreibung:

Apoptose ist ein normaler physiologischer Prozess, der im Prozess der embryonalen Entwicklung und der Wartung von Tissue Homostase auftritt. Es wird von vielen morphologischen Veränderungen begleitet. Unter ihnen ist der Verlust der Zellmembran eine der frühen Eigenschaften der Apoptose. In normalen Zellen ist Phosphotidylserin (PS) nur auf der Innenseite der Phospholipid-Bilayer der Zellmembran verteilt. In der frühen Bühne der Apoptose wird PS jedoch von der Innenseite der Lipidmembran zur Außenseite umdrehen, um sie an der Außenseite der Zelle freizulegen. Annexin V (Anhang V) ist ein ca2 + -dedrendendes Phospholipid-Bindungsprotein mit einer hohen Affinität für PS und bindet insbesondere an Zellen, die PS ausgesetzt sind. Daher wird Anhangin V als eine der Indikatoren zum Erkennen der frühen Zellapoptose verwendet. Propidiumjodid (PI) ist ein Nukleinsäurerfarbstoff. Es kann keine normalen Zellen mit intakten Zellmembranen und frühen apoptotischen Zellen eindringen, sondern können die Zellmembranen spät apoptotischer und nekrotischer Zellen eindringen und den Kern färben.

Dieses Produkt verwendet EGFP (verbessertes grünes fluoreszierendes Protein) und Anhang-V, um ein Fusionsprotein als Erkennungssonde zu bilden, um eine frühe Zellapoptose zu erkennen. Gleichzeitig wird PI verwendet, um überlebende Zellen von nekrotischen und späten apoptotischen Zellen zu unterscheiden. Wenn Annexin V-EGFP in Kombination mit PI verwendet wird, zeigen lebende Zellen negative Färbung (Anhang V- / PI-), frühe apoptotische Zellen zeigen einzelne Fluoreszenz-positive (Annexin V + / PI-), und späte apoptotische Zellen und nekrotische Zellen zeigen zwei Fluoreszenz positiv (Annexin V + / PI +). Dieses Kit eignet sich für die Durchflusszytometrie- oder Fluoreszenzmikroskoperkennung. Gleichzeitig, da EGFP und Anhang V 1: 1 verschmolzen sind, kann dieses Produkt auch apoptotische Zellen quantitativ erkennen.

Lagerung und Transport

Transport von Eisbeutel (Nasseis);

Dieses Kit wird bei -20 ° C gelagert und hat eine Gültigkeitsdauer von 12 Monaten.

Komponente:

Komponentennummer

Komponente

G1510-50T.

G1510-100T.

G1510-1.

Annexin V-EGFP

250 μl.

2 × 250 μl

G1510-2.

Propidium Jodid (PI)

250 μl.

2 × 250 μl

G1510-3.

1 × Bindungspuffer

25ml

2 × 25 ml

Produktbenutzerhandbuch

1 stück

Betriebsschritte:

1. Suspensionszellen: Nehmen Sie die Zellsuspension und sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 500 g für 5 min bei 4 ° C;

Anhaftende Zellen: Sammeln Sie zunächst den Zellkulturüberstand. Nach der Verdauung mit EDTA-Free Trypsin (G4002 empfohlen) kombinieren Sie mit dem Zellkulturüberstand und sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 500 g für 5 min bei 4 ° C. Die Trypsin-Verdauungszeit sollte nicht zu lang sein, um übermäßige Verdauung zu vermeiden und falsche Positive zu verursachen.

2. Waschen Sie die Zellen zweimal mit vorgekühlten PBS (G4202 empfohlen) und sammeln Sie die Zellen mit jeder Zentrifugation bei 500 g jeweils 5 Minuten bei 4 ° C;

3. sanft resuspendieren Sie die Zellen im vorgekühlten 1 × Bindungspuffer und stellen Sie die Zellkonzentration auf 1 bis 5 × 106 / ml ein.

4. Nehmen Sie 100 μl Zellsuspension, fügen Sie 5 μl Annexin V-EGFP und 5 μl PI hinzu, mischen Sie sanft und schützen Sie sie bei Raumtemperatur 8-10 min;

5. Fügen Sie 400 μl vorkühlgekühlter 1 ×-Bindungspuffer, schütteln, sanft schütteln und die Erfassung mit einem Durchflusszytometer oder einem Fluoreszenzmikroskop innerhalb von 1 h durchführen.

Ergebnisanalyse

1. Durchflusszytometrie.

A. Wählen Sie die entsprechende Spannung aus und stellen Sie die Lichtkompensation während der Durchflusszytometrieerfassung und -analyse ein. Es wird empfohlen, eine negative Steuerung (nicht mit Anhang V-EGFP und PI gekennzeichnet) einzustellen, um die Spannung mit Ausnahme der experimentellen Gruppe einzustellen, mit Ausnahme der experimentellen Gruppe und einer Einkennzeichnungssteuerung (nur Anhang hinzufügen) V-EGFP- und PI-ID-Zellen hinzufügen). werden verwendet, um die Entschädigung anzupassen;

B. Referenzbeispiele für die Erfassung und Analyse der Durchflusszytometrie:

Jurkat T-Lymphomzellen wurden 6 Stunden mit 5 μm Camptothecin induziert. Siehe das obige experimentelle Verfahren und verwenden Sie die Fließzytometrie, um die Ergebnisse zu erkennen. Die Ergebnisse sind in der folgenden Abbildung dargestellt.

Die maximale Anregungswellenlänge von EGFP beträgt 488 nm und die maximale Emissionswellenlänge beträgt 507 nm; Die maximale Anregungswellenlänge des PI-DNA-Komplexes beträgt 535 nm und die maximale Emissionswellenlänge beträgt 615 nm. Das Zweidispersionspunkt-Diagramm wurde von der relevanten Analysesoftware des Durchflusszytometers mit EGFP auf der Abszisse und PI auf der Ordinate gezeichnet. In einem typischen Experiment haben lebende Zellen keine Fluoreszenz, und die gestreuten Punkte befinden sich im ersten Quadranten der unteren linken Seite. Die apoptotischen Zellen in der frühen Bühne haben eine starke grüne Fluoreszenz, und die zerstreuten Punkte befinden sich im zweiten Quadranten des rechtens. Späte apoptotische Zellen und nekrotische Zellen zeigen eine rote und grüne Doppelfluoreszenz, und die zerstreuten Punkte befinden sich im dritten Quadranten des oberen Rechts.

2. Fluoreszenzmikroskopinspektion

Fügen Sie mit Anhang V-EGFP und PI auf dem Glasschieber 5-10 μl Zellsuspension hinzu, decken Sie ihn mit einem Deckglas ab, und beobachten Sie unter einem Fluoreszenzmikroskop mit einem Zweifarbfilter. Annexin V-EGFP zeigt ein grünes Fluoreszenzsignal. PI hat ein rotes fluoreszierendes Signal.

Anmerkungen:

1. Während des gesamten Experiments sollte der Betrieb so sanft wie möglich sein, um den Zellenbruch zu vermeiden und die experimentellen Ergebnisse zu beeinflussen.

2. Das Waschen der Zellen mit PBS kann nicht weggelassen werden, und nehmen Sie gleichzeitig die restlichen PBS so weit wie möglich aus.

3. Wenn Sie Trypsin zur Verdauungszellen verwenden, sollten Sie vorsichtig sein, um künstliche Schäden an den Zellen zu vermeiden und die Verdauungszeit zu steuern. Wenn die Verdauungszeit zu kurz ist, müssen die Zellen abgeblasen werden, um abzugleichen, die wahrscheinlich mechanische Beschädigung der Zellmembran verursacht; Wenn die Verdauungszeit zu lang ist, ist die Zellmembran auch anfällig für Beschädigungen. Beeinflussen die Testergebnisse. Darüber hinaus kann Pankreatin mit EDTA nicht verwendet werden. EDTA beeinträchtigt die Bindung von Annexin V und PS.

Nach den anhaftenden Zellen werden durch Apoptose stimuliert, wenn einige der Zellen schweben, es ist notwendig, den Zellkulturüberstand und die anhaftenden Zellen zu sammeln und sie gleichzeitig zu färben, wodurch die Ergebnisse genauer werden.

5. Annexin V-EGFP und PI sind empfindlich auf Licht, vermeiden Sie bitte Licht während des Betriebs. Der Test sollte nach der Reaktion so schnell wie möglich durchgeführt werden.

6. Bitte tragen Sie während des Experiments Laborkleidung und Einweghandschuhe, um eine Kontamination zu vermeiden und sicherzustellen.

Dieses Produkt ist nur für wissenschaftliche Forschungszwecke, nicht für die klinische Diagnose!

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