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Anteil an:

Annexin V-IF647 / PI-Zell-Apoptose-Erkennungskit

Volumen: 50t.
Verfügbarkeitsstatus:
  • G1514-50T.
  • Servicebio
  • ServiceBio.

Produktbeschreibung

Produktinformation:

Produktname

Katze. Nein.

Volumen

Annexin V-IF647 / PI-Zell-Apoptose-Erkennungskit

G1514-50T.

50t.

G1514-100T.

100t Jahre

Produktbeschreibung:

Apoptose ist ein normaler physiologischer Prozess, der im Prozess der embryonalen Entwicklung und der Wartung von Tissue Homostase auftritt. Es wird von vielen morphologischen Veränderungen begleitet. Unter ihnen ist der Verlust der Zellmembran eine der frühen Eigenschaften der Apoptose. In normalen Zellen ist Phosphotidylserin (PS) nur auf der Innenseite der Phospholipid-Bilayer der Zellmembran verteilt, aber im frühen Stadium der Apoptose dreht sich PS von der Innenseite der Lipidmembran an die Außenseite, wodurch es freigesetzt wird an der Außenseite der Zelle. Annexin V (Anhang V) ist ein CA2 + -Drendendes Phospholipid-Bindungsprotein mit hoher Affinität für PS und bindet insbesondere an Zellen, die PS ausgesetzt sind. Daher wird Anhangin V als eine der Indikatoren zum Erkennen der frühen Zellapoptose verwendet. Propidiumjodid (PI) ist ein Nukleinsäurerfarbstoff. Es kann keine normalen Zellen mit intakten Zellmembranen und frühen apoptotischen Zellen eindringen, sondern können die Zellmembranen spät apoptotischer und nekrotischer Zellen eindringen und den Kern färben.

Dieses Produkt verwendet das mit IF647-Fluoreszenz-Farbstoff-Molekül, das Anhangin V als Erkennungssonde markiert ist, um eine frühe Zellproptose zu erkennen. Gleichzeitig wird PI verwendet, um überlebende Zellen von nekrotischen und späten apoptotischen Zellen zu unterscheiden. Kombinierte Verwendung von Anhang V-IF647 und PI, Live-Zellen zeigen die negative Färbung (Anhang V- / PI-), frühe apoptotische Zellen zeigen einzelne Fluoreszenz positiv (Annexin V + / PI-), und späte apoptotische Zellen und nekrotische Zellen zeigen eine doppelte Fluoreszenz positiv (Annexin V + / PI +). Dieses Kit eignet sich für die Durchflusszytometrie- oder Fluoreszenzmikroskoperkennung.

Lagerung und Transport

Transport in nassem Eis; Aufbewahren bei 2-8 ° C im Dunkeln, gültig für 12 Monate.

Komponente:

Komponentennummer

Komponente

G1514-50T.

G1514-100T.

G1514-1.

Annexin V-IF647

250 μl.

2 × 250 μl

G1514-2.

Propidium Jodid (PI)

250 μl.

2 × 250 μl

G1514-3.

1 × Bindungspuffer

25 ml.

2 × 25 ml

Produktbenutzerhandbuch

1 stück

Betriebsschritte:

1. Suspensionszellen: Nehmen Sie die Zellsuspension und sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 500 g für 5 min bei 4 ° C;

Anhaftende Zellen: Sammeln Sie zunächst den Zellkulturüberstand. Nach der Verdauung mit EDTA-Free Trypsin (G4002 empfohlen) kombinieren Sie mit dem Zellkulturüberstand und sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 500 g für 5 min bei 4 ° C. Die Trypsin-Verdauungszeit sollte nicht zu lang sein, um übermäßige Verdauung zu vermeiden und falsche Positive zu verursachen.

2. Waschen Sie die Zellen zweimal mit vorgekühlten PBS (G4202 empfohlen) und sammeln Sie die Zellen mit jeder Zentrifugation bei 500 g jeweils 5 Minuten bei 4 ° C;

3. sanft resuspendieren Sie die Zellen im vorgekühlten 1 × Bindungspuffer und stellen Sie die Zellkonzentration auf 1 bis 5 × 106 / ml ein.

4. Nehmen Sie 100 μl Zellsuspension, fügen Sie 5 μl Annexin V-IF647 und 5 μl Pi hinzu, mischen Sie sanft und schützen Sie sie vorsichtig bei Raumtemperatur 8-10 min;

5. Fügen Sie 400 μl vorkühlgekühlter 1 ×-Bindungspuffer, schütteln, sanft schütteln und die Erfassung mit einem Durchflusszytometer oder einem Fluoreszenzmikroskop innerhalb von 1 h durchführen.

Ergebnisanalyse

1. Durchflusszytometrie.

A. Wählen Sie die entsprechende Spannung aus und stellen Sie die Lichtkompensation während der Durchflusszytometrieerfassung und -analyse ein. Es wird empfohlen, eine negative Steuerung (ohne Marker) einzubauen, um die Spannungs- und Einlampensteuerung einzustellen (nur Anhang V-IF647 und Anhang V-IF647) mit Ausnahme der experimentellen Gruppe. Fügen Sie nur PI hinzu) zur Anpassung und Entschädigung;

B. Referenzbeispiele für die Erfassung und Analyse der Durchflusszytometrie:

Jurkat T-Lymphomzellen wurden mit 5 μm Camptothecin für 6 Stunden induziert. Siehe das obige experimentelle Verfahren und verwenden Sie die Fließzytometrie, um die Ergebnisse zu erkennen. Die Ergebnisse sind in der folgenden Abbildung dargestellt.

Die maximale Anregungswellenlänge von IF647 beträgt 656 nm und die maximale Emissionswellenlänge beträgt 670 nm; Die maximale Anregungswellenlänge des PI-DNA-Komplexes beträgt 535 nm und die maximale Emissionswellenlänge beträgt 615 nm. Das Zweidispersionspunktdiagramm wird von der relevanten Analysesoftware des Durchflusszytometers gezeichnet, und die IF647 ist auf der Abszisse und der PI ist auf der Ordinate. In einem typischen Experiment haben lebende Zellen keine Fluoreszenz, und die gestreuten Punkte befinden sich im ersten Quadranten der unteren linken Seite. Die apoptotischen Zellen in der frühen Bühne haben eine starke rosa Fluoreszenz, und die zerstreuten Punkte befinden sich im zweiten Quadranten des rechtens. Späte apoptotische Zellen und nekrotische Zellen präsentieren rosa und rote doppelte Fluoreszenz, und die zerstreuten Punkte befinden sich im dritten Quadranten des oberen Rechts.

2. Fluoreszenzmikroskopinspektion

Fügen Sie 6 μl Anhang V-IF647 und PI doppelt gefärbte Zellsuspension auf dem Glasschieber hinzu, decken Sie es mit einem Deckglas ab und beobachten Sie unter einem Fluoreszenzmikroskop mit einem Zweifarbfilter. Annexin V-IF647 hat ein rosa Fluoreszenzsignal und PI ist ein rotes Fluoreszenzsignal.

Anmerkungen:

1. Während des gesamten Experiments sollte der Betrieb so sanft wie möglich sein, um den Zellenbruch zu vermeiden und die experimentellen Ergebnisse zu beeinflussen.

2. Das Waschen der Zellen mit PBS kann nicht weggelassen werden, und nehmen Sie gleichzeitig die restlichen PBS so weit wie möglich aus.

3. Wenn Sie Trypsin zur Verdauungszellen verwenden, sollten Sie vorsichtig sein, um künstliche Schäden an den Zellen zu vermeiden und die Verdauungszeit zu steuern. Wenn die Verdauungszeit zu kurz ist, müssen die Zellen abgeblasen werden, um abzugleichen, die wahrscheinlich mechanische Beschädigung der Zellmembran verursacht; Wenn die Verdauungszeit zu lang ist, ist die Zellmembran auch anfällig für Beschädigungen. Beeinflussen die Testergebnisse. Darüber hinaus kann Pankreatin mit EDTA nicht verwendet werden. EDTA beeinträchtigt die Bindung von Annexin V und PS.

Nach den anhaftenden Zellen werden durch Apoptose stimuliert, wenn einige der Zellen schweben, es ist notwendig, den Zellkulturüberstand und die anhaftenden Zellen zu sammeln und sie gleichzeitig zu färben, wodurch die Ergebnisse genauer werden.

5. Annexin V-IF647 und PI sind empfindlich gegen Licht, vermeiden Sie während des Betriebs Licht. Der Test sollte nach der Reaktion so schnell wie möglich durchgeführt werden.

6. Bitte tragen Sie während des Experiments Laborkleidung und Einweghandschuhe, um eine Kontamination zu vermeiden und sicherzustellen.

Dieses Produkt ist nur für wissenschaftliche Forschungszwecke, nicht für die klinische Diagnose!

G1514-50TB.

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