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Anteil an:

Annexin V-PE / 7-AAD-Zell-Apoptose-Erkennungskit

Volumen: 50t.
Verfügbarkeitsstatus:
  • G1512-50T.
  • Servicebio
  • ServiceBio.

Produktbeschreibung

Produktinformation:

Produktname

Katze. Nein.

Volumen

Annexin V-PE / 7-AAD-Zell-Apoptose-Erkennungskit

G1512-50T.

50t.

G1512-100T.

100t Jahre

Produktbeschreibung:

Apoptose ist ein normaler physiologischer Prozess, der im Prozess der embryonalen Entwicklung und der Wartung von Tissue Homostase auftritt. Es wird von vielen morphologischen Veränderungen begleitet. Unter ihnen ist der Verlust der Zellmembran eine der frühen Eigenschaften der Apoptose. In normalen Zellen ist Phosphotidylserin (PS) nur auf der Innenseite der Phospholipid-Bilayer der Zellmembran verteilt, aber im frühen Stadium der Apoptose dreht sich PS von der Innenseite der Lipidmembran an die Außenseite, wodurch es freigesetzt wird an der Außenseite der Zelle. Annexin V (Anhang V) ist ein CA2 + -Drendendes Phospholipid-Bindungsprotein mit hoher Affinität für PS und bindet insbesondere an Zellen, die PS ausgesetzt sind. Daher wird Anhangin V als eine der Indikatoren zum Erkennen der frühen Zellapoptose verwendet. 7-Aad ist ein Nukleinsäurerfarbstoff, der nur in die Zellmembran spät apoptotischer und toter Zellen eindringen und den Kern färbt, um späte apoptotische und nekrotische Zellen zu markieren.

Dieses Produkt verwendet Phycoerythrin (Phycoerythrin, PE), um Anhang-V als Erkennungssonde zu kennzeichnen, um eine frühe Zellapoptose zu erkennen. Gleichzeitig wird 7-Aad verwendet, um Überlebenszellen von nekrotischen und späten apoptotischen Zellen zu unterscheiden. Kombinierte Verwendung von Annexin V-PE und 7-AAD, Live-Zellen zeigen negative Färbung (Annexin V- / 7-AAD-), frühe apoptotische Zellen zeigen ein einzelnes Fluoreszenz positiv (Annexin V + / 7-AAD-) und späte apoptotische Zellen und nekrotische Zellen zeigten eine doppelte Fluoreszenz positiv (Annexin V + / 7-AAD +). Dieses Kit eignet sich für die Durchflusszytometrie- oder Fluoreszenzmikroskoperkennung.

Lagerung und Transport

Transport in nassem Eis;

Aufbewahren bei 2-8 ° C im Dunkeln, gültig für 12 Monate.

Komponente:

Komponentennummer

Komponente

G1512-50T.

G1512-100T.

G1512-1.

Annexin V-Pe

250 μl.

2 × 250 μl

G1512-2.

7-AAD.

250 μl.

2 × 250 μl

G1512-3.

1 × Bindungspuffer

25 ml.

2 × 25 ml

Produktbenutzerhandbuch

1 stück

Betriebsschritte:

1. Suspensionszellen: Nehmen Sie die Zellsuspension und sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 500 g für 5 min bei 4 ° C;

Anhaftende Zellen: Sammeln Sie zunächst den Zellkulturüberstand. Nach der Verdauung mit EDTA-Free Trypsin (G4002 empfohlen) kombinieren Sie mit dem Zellkulturüberstand und sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 500 g für 5 min bei 4 ° C. Die Trypsin-Verdauungszeit sollte nicht zu lang sein, um übermäßige Verdauung zu vermeiden und falsche Positive zu verursachen.

2. Waschen Sie die Zellen zweimal mit vorgekühlten PBS (G4202 empfohlen) und sammeln Sie die Zellen mit jeder Zentrifugation bei 500 g jeweils 5 Minuten bei 4 ° C;

3. sanft resuspendieren Sie die Zellen im vorgekühlten 1 × Bindungspuffer und stellen Sie die Zellkonzentration auf 1 bis 5 × 106 / ml ein.

4. Nehmen Sie 100 μl Zellsuspension, fügen Sie 5 μl Annexin V-PE und 5 μl 7-AAD hinzu, mischen Sie sanft und schützen Sie sich vor Licht bei Raumtemperatur für 8-10 min;

5. Fügen Sie 400 μl vorkühlgekühlter 1 ×-Bindungspuffer, schütteln, sanft schütteln und die Erfassung mit einem Durchflusszytometer oder einem Fluoreszenzmikroskop innerhalb von 1 h durchführen.

Ergebnisanalyse

1. Durchflusszytometrie.

A. Wählen Sie die entsprechende Spannung aus und stellen Sie die Lichtkompensation während der Durchflusszytometrieerfassung und -analyse ein. Es wird empfohlen, eine negative Steuerung (ohne Marker) zum Einstellen der Spannungs- und Einzeletikettensteuerung (nur Annexin V-PE und nur 7-Aad) für die Einstellung und Kompensation einzustellen;

B. Referenzbeispiele für die Erfassung und Analyse der Durchflusszytometrie:

Jurkat T-Lymphomzellen wurden mit 5 μm Camptothecin für 6 Stunden induziert. Siehe das obige experimentelle Verfahren und verwenden Sie die Fließzytometrie, um die Ergebnisse zu erkennen. Die Ergebnisse sind in der folgenden Abbildung dargestellt.

Die maximale Anregungswellenlänge von PE beträgt 565 nm und die maximale Emissionswellenlänge beträgt 578 nm; Die maximale Anregungswellenlänge von 7-Aad beträgt 546 nm und die maximale Emissionswellenlänge beträgt 647 nm. Das Zweidispersionspunkt-Diagramm wurde von der jeweiligen Analysesoftware des Durchflusszytometers mit PE auf der Abszisse und 7-Aad auf der Ordinate gezeichnet. In einem typischen Experiment haben lebende Zellen keine Fluoreszenz, und die gestreuten Punkte befinden sich im ersten Quadranten der unteren linken Seite. Die apoptotischen Zellen in der frühen Bühne haben eine starke orange-rote Fluoreszenz, und die zerstreuten Punkte befinden sich im zweiten Quadranten des rechtens. Späte apoptotische Zellen und nekrotische Zellen bieten orange-rote und rosafarbene doppelte Fluoreszenz an, und die zerstreuten Punkte befinden sich im dritten Quadranten des oberen Rechts.

2. Fluoreszenzmikroskopinspektion

Fügen Sie mit Anhang V-PE und 7-Aad auf dem Glasschieber 5-10 μl Zellsuspension hinzu, die mit einem Deckglas mit einem Deckglas abdecken und unter einem Fluoreszenzmikroskop mit einem Zweifarbfilter beobachtet werden. Annexin V-PE ist orang-rotes fluoreszierendes Signal, 7-Aad ist das rosafarbene fluoreszierende Signal.

Anmerkungen:

1. Während des gesamten Experiments sollte der Betrieb so sanft wie möglich sein, um den Zellenbruch zu vermeiden und die experimentellen Ergebnisse zu beeinflussen.

2. Das Waschen der Zellen mit PBS kann nicht weggelassen werden, und nehmen Sie gleichzeitig die restlichen PBS so weit wie möglich aus.

3. Wenn Sie Trypsin zur Verdauungszellen verwenden, sollten Sie vorsichtig sein, um künstliche Schäden an den Zellen zu vermeiden und die Verdauungszeit zu steuern. Wenn die Verdauungszeit zu kurz ist, müssen die Zellen abgeblasen werden, um abzugleichen, die wahrscheinlich mechanische Beschädigung der Zellmembran verursacht; Wenn die Verdauungszeit zu lang ist, ist die Zellmembran auch anfällig für Beschädigungen. Beeinflussen die Testergebnisse. Darüber hinaus kann Pankreatin mit EDTA nicht verwendet werden. EDTA beeinträchtigt die Bindung von Annexin V und PS.

Nach den anhaftenden Zellen werden durch Apoptose stimuliert, wenn einige der Zellen schweben, es ist notwendig, den Zellkulturüberstand und die anhaftenden Zellen zu sammeln und sie gleichzeitig zu färben, wodurch die Ergebnisse genauer werden.

5. Annexin V-PE und 7-AAD sind empfindlich gegen Licht, vermeiden Sie bitte Licht während des Betriebs. Der Test sollte nach der Reaktion so schnell wie möglich durchgeführt werden.

6. Bitte tragen Sie während des Experiments Laborkleidung und Einweghandschuhe, um eine Kontamination zu vermeiden und sicherzustellen.

Dieses Produkt ist nur für wissenschaftliche Forschungszwecke, nicht für die klinische Diagnose!

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