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Anteil an:

BRDU-Erkennungskit für DNA-Nachweis

Volumen:50t.

Verfügbarkeitsstatus:
  • G4102-50T.
  • Servicebio

Produktbeschreibung

Produktinformation

Produktname

Katze. Nein.

Spezifikation

BRDU-Erkennungskit.

G4102-50T.

50t.

G4102-100T.

100t Jahre

Produkteinführung:

Dieses Produkt-BRDU-Erkennungskit wird zur Erkennung von Zellproliferationskennungen von Zellen und Gewebeabschnitten verwendet. BRDU (5-Brom-2-Desoxyuridin), das 5-Bromodeoxyuridin ist, ist ein Analogon von Thymidin (T). Das Prinzip dieses Kits ist, dass BRDU Thymidin T durch Wettbewerb ersetzen kann. Geben Sie die DNA-Synthesephase (S-Phase) ein. Wenn BRDU in Zellen in der kräftigen Unterteilung eingebaut ist, können die Zellen, die BRDU enthielten, durch Verwendung von Anti-BRDU-Antikörper und Antikörper-Ligase oder Fluorescein als Indikatorsystem erfasst werden, und kombiniert mit anderen Zellmarkierungen für die doppelte Etikettierung, die Proliferation von Zellen kann beurteilt werden Typen, Proliferationsgeschwindigkeit usw. sind für das Studium der Zelldynamik von großer Bedeutung. BRDU wechselt Gewebezellen durch intravitale Injektion oder Zellkultur, und die in sie eingebaute DNA wird genau positioniert, was den Niveau neu synthetisierter DNA in S-Phase-Zellen effektiv widerspiegeln kann und von der inneren und äußeren Umgebung der Zelle weniger beeinflusst wird und das Etikett wird nicht verloren gehen.

Lagerung und Transport

Transport von Eisbeutel (Nasseis); Bruchfluid, Blockierflüssigkeit (3% BSA), 1 m HCl, kann bei 4 ° C gelagert werden, 4% Paraformaldehyd kann bei Raumtemperatur gespeichert werden, die Anti-BRDU (Maus MAB) muss bei -20 ° C gelagert werden, Ablauf Datum 12 Monate.

Komponente

Komponentennummer

Komponente

G4102-50T.

G4102-100T.

G4102-1.

Bruchflüssigkeit

30 ml.

30 ml.

G4102-2.

Dichtungsflüssigkeit (3% BSA)

30 ml.

30 ml.

G4102-3.

4% Paraformaldehyd.

30 ml.

30 ml.

G4102-4.

1 m HCl.

30 ml.

30 ml.

G4102-5.

Anti-BRDU (Maus MAB)

50 μl.

100 μl.

Produktbenutzerhandbuch

1 stück

1 stück

Experiment Vorbereitung

1. Bringen Sie Ihren eigenen PBS-Puffer (empfohlen G4202), sekundärer Antikörper, Gradient Ethanol, Montagetabletten usw.;

2. Bringen Sie Ihre eigene Atomfärbungslösung mit, empfehlen Sie den G1004-Hämatoxylin-Fleck oder G1012 DAPI-Fleck (gebrauchsfertig);

3. Bereiten Sie Anti-BRDU-Primärantikörper-Arbeitslösung vor: Verdünne Anti-BRDU (Maus MAB) mit Blockierlösung (3% BSA) 100-fach, um die primäre Anti-BRDU-Primärantikörper-Arbeitslösung vorzubereiten, sie auf den aktuellen Gebrauch vorzubereiten, bei 4 ℃ aufbewahren;

4. Sekundäre Antikörper-Arbeitslösung: Bereiten Sie Ihre eigene HRP-markierte (anschließende weiße Lichtkennung, DAB-Farbkit, empfohlener G1212) oder fluoreszierter markierter Sekundärantikörper vor, und verdünnen Sie mit PBS, um die sekundäre Antikörper-Arbeitsflüssigkeit vorzubereiten .

Betriebsschritte:

Zellprobe:

1. Zellvorbereitung: Zellvorbereitung vorbereiten, um sicherzustellen, dass sich die Zellen in einem normalen Zustand befinden und sich gut anhalten;

2. Brdu-Inkubation: Zellen werden mit brduhaltigem Medium in einem Inkubator im Dunkeln für einen bestimmten Zeitraum inkubiert. Die Konzentration von BRDU und der Inkubationszeit der Zellen unterscheiden sich je nach Zelltyp. Es wird empfohlen, die besten Bedingungen des Vorversuchs zu erkunden. Die experimentellen Bedingungen der getesteten Zellen in den Vorsichtsmaßnahmen dienen als Referenz;

3. Zellfixierung: Die oben genannten Zellen wurden mit BRDU inkubiert und jeweils 5 Minuten lang dreimal mit PBS gewaschen. Fügen Sie 1 ml 4% Paraformaldehyd zur Öffnung hinzu, um die Zellen abzudecken, und fixieren Sie 20-30 min bei Raumtemperatur. Mit PBS 3-mal waschen, 5 Minuten jedes Mal;

4. Permeabilität: Fügen Sie die Öffnung, um die Zellen für 8-10 Minuten lang zu bedecken, mit PBS 3-mal 5 Minuten mit PBS waschen;

5. Kernfärbung (optional):

Für die anschließende weiße Lichtkennung färben Sie den Zellkern mit Hämatoxylin: Fügen Sie die Hämatoxylin-Färbungslösung für 5 min bei Raumtemperatur, saugt die Hämatoxylin-Färbungslösung an und waschen Sie dreimal mit PBS für jeweils 5 Minuten;

Für die anschließende Fluoreszenzerkennung färben Sie den Zellkern mit DAPI: Fügen Sie die Dapi-Farbstofflösung für 5 Minuten bei Raumtemperatur, um die DAPI-Farbstofflösung aufzurichten, und waschen Sie jeweils dreimal mit PBS mit PBS;

6. Wiedereinfixierung: Fügen Sie 4% Paraformaldehyd tropfenweise zur Well-Platte und inkubieren Sie 10 Minuten bei Raumtemperatur, waschen Sie jeweils dreimal mit PBS, 5 Minuten;

7. Ansäuerung: Fügen Sie den Zellen, um die Zellen zu decken, um 10 Minuten bei 37 ° C zu bedecken, 3 mal mit PBS, 5 min bei jeder Zeit waschen;

8. Nachfixierung: Fügen Sie 4% Paraformaldehyd tropfenweise in die Well-Platte wieder hinzu, inkubieren Sie bei Raumtemperatur 10 min inkubieren, mit PBS 3-mal, 5 min jedes Mal waschen;

9. Blockierung: Fügen Sie die Blockierlösung (3% BSA) tropfenweise auf die Well-Platte und inkubieren Sie 30 Minuten bei Raumtemperatur. Absorbieren und verwerfen Sie die Blockierlösung, nicht reinigen;

10. Anti-BRDU-Antikörper-Inkubation: Fügen Sie die Primärantikörper-Arbeitslösung Anti-BRDU tropfenweise, um die Zellen abzudecken, und inkubieren Sie über Nacht bei 4 ° C. Aspirieren und verwerfen Sie die Anti-BRDU-Primärantikörper-Arbeitslösung, waschen Sie mit PBS 3-mal, 5 min jedes Mal;

11. Sekundärer Antikörper-Inkubation: Lassen Sie die sekundäre Antikörper-Arbeitslösung in die Well-Platte fallen, um die Zellen abzudecken, und inkubieren Sie bei Raumtemperatur 1 h. Aspirieren und verwerfen Sie die Arbeitslösung des sekundären Antikörpers, und waschen Sie mit PBS 3-mal, 5 min jedes Mal. Beachten Sie, dass Sie, wenn Sie einen fluoreszierenden markierten sekundären Antikörper verwenden, ein Licht während der Inkubation und das Waschen vermeiden.

12. Abdeckung und mikroskopische Untersuchung:

Wenn es sich um einen hrp-markierten sekundären Antikörper handelt, verwenden Sie DAB-Chromogene Reagens (G1212 empfohlen), um die Farbe der Zellprobe, Dehydratisierung und Transparenz zu entwickeln. Verwenden Sie eine spitze Pinzette, um den Schieber sanft aufzunehmen, und montieren Sie es auf einem sauberen Glasrutschen auf den Kopf. Mikroskopbeobachtung;

Wenn es sich um einen fluoreszierenden markierten sekundären Antikörper handelt, fällen Sie eine Anti-Fluoreszenz-Abschreckhalterung (G1401 empfohlen) auf dem Reinglasser, nehmen Sie den Schieber sanft mit spitzen Pinzetten auf, schnallen Sie sich auf den Kopf der Glasrutsche auf und montieren Sie den Rutschen, beobachten Sie mit ein Fluoreszenzmikroskop;

Tissue-Sektion Proben:

1. Tiervorbereitung: Bereiten Sie experimentelle Tiere im Voraus vor und führen Sie die BRDU-Kennzeichnung in vivo aus, siehe WGB8010. Nehmen Sie nach der Beschriftung in vivo Materialien, fixieren und bereiten Sie Paraffinabschnitte nach experimentellen Bedürfnissen auf;

2. Gewebe-Paraffinabschnitte sind entparaffiniert und rehydratisiert;

3. Reparatur: Gruppieren Sie den Bürste, um das Gewebe zu kreisen, einzuführen, die Scheibe in die Antigen-Retrieval-Lösung eintauchen und durch Mikrowellenheizung zu reparieren. Natürliche Kühlung

4. Kernfärbung (optional):

Für die anschließende weiße Lichtkennung färben Sie den Zellkern mit Hämatoxylin: Fügen Sie die Hämatoxylin-Färbungslösung für 5 min bei Raumtemperatur, saugt die Hämatoxylin-Färbungslösung an und waschen Sie dreimal mit PBS für jeweils 5 Minuten;

Für die anschließende Fluoreszenzerkennung färben Sie den Zellkern mit DAPI: Fügen Sie die Dapi-Farbstofflösung für 5 Minuten bei Raumtemperatur, um die DAPI-Farbstofflösung aufzurichten, und waschen Sie jeweils dreimal mit PBS mit PBS;

5. Wiedereinfixierung: Fügen Sie 4% Paraformaldehyd tropfenweise zum Gewebe und inkubieren Sie 10 min bei Raumtemperatur inkubieren, 3 mal mit PBS, 5 min jedes Mal waschen;

6. Ansäuerung: Fügen Sie den Scheiben 1 m HCl hinzu, um das Gewebe abzudecken, um 10 Minuten bei 37 ° C zu behandeln, sie mit PBS 3-mal, 5 min jedes Mal waschen;

7. Nachfixierung: Fügen Sie 4% Paraformaldehyd tropfenweise zu der Well-Platte wieder hinzu und inkubieren Sie 10 Minuten lang, waschen Sie mit PBS 3-mal, 5 Minuten jedes Mal;

8. Endogene Peroxidase-Abschrecken (optional): Fügen Sie 3% H2O2 tropfenweise zu den Scheiben und inkubieren Sie 25-30 Minuten bei Raumtemperatur, um endogene Peroxidase zu entfernen. Dann wurden die Scheiben dreimal mit PBS, 5 Minuten, jedes Mal gewaschen;

9. Blockierung: Fügen Sie die Blockierlösung (3% BSA) an die Scheiben hinzu, um das Gewebe abzudecken, und inkubieren Sie 30 Minuten bei Raumtemperatur. Entfernen Sie die Blockierflüssigkeit, nicht reinigen;

10. Anti-BRDU-Antikörper-Inkubation: Fügen Sie der Scheiben Anti-BRDU-Primärantikörper-Arbeitslösung hinzu, um das Gewebe abzudecken, und inkubieren Sie über Nacht bei 4 ° C. Entfernen Sie die Anti-BRDU-Primär-Antikörper-Arbeitslösung, waschen Sie dreimal mit PBS, 5 min jedes Mal;

11. Sekundäre Antikörper-Inkubation: Fügen Sie die Arbeitslösung des sekundären Antikörpers mit dem Abschnitt, um das Gewebe abzudecken, und inkubieren Sie bei Raumtemperatur 1 h. Entfernen Sie die Arbeitslösung des sekundären Antikörpers, waschen Sie dreimal mit PBS, 5 Minuten, jedes Mal. Beachten Sie, dass Sie, wenn Sie einen fluoreszierenden markierten sekundären Antikörper verwenden, ein Licht während der Inkubation und das Waschen vermeiden.

12. Abdeckung und mikroskopische Untersuchung:

Wenn es sich um den sekundären Antikörper von HRP handelt, verwenden Sie das tutigen chromogene Reagens (G1212 empfohlen), um die Farbe des Gewebeabschnitts zu entwickeln, dehydrieren, transparent und nach der Montage unter dem Mikroskop zu beobachten;

Wenn es sich um einen fluoreszierenden markierten sekundären Antikörper handelt, fügen Sie tropfenweise Anti-Fluoreszenz-Abschreck-Montagetabletten (G1401 empfohlen) hinzu, um mit einem Fluoreszenzmikroskop zu montieren und zu beobachten.

Beobachtung der Ergebnisse.

Wenn der Kern mit HRP-markiertem sekundärem Antikörper erkannt wird, ist der Kern dunkelblau, und die proliferierenden Zellen sind braun. Wenn es sich um einen fluoreszierenden markierten sekundären Antikörper handelt, zeigt der Kern eine blaue Fluoreszenz (Ex = 358 nm, em = 461 nm), und die proliferierenden Zellen zeigen die Fluoreszenz des entsprechenden sekundären Antikörpers.

Anmerkungen:

1. Bei Zell-Slide-Proben beziehen sich die Konzentrations- und Verarbeitungszeit von BRDU auf die Zelltypen. Im Allgemeinen sind die Konzentration und Zeit, die zur Behandlung von Tumorzellen erforderlich sind, niedrig. Zellen mit langsamer Proliferation wie Fibroblasten oder Epithelzellen müssen die Konzentration erhöhen und die Aktionszeit verlängern. Der empfohlene Konzentrationsbereich beträgt 20-100 μm und die Aktionszeit beträgt 40 min. -4 Stunden können entsprechend den spezifischen Zelltypen eingestellt werden.

Die folgende Tabelle zeigt die allgemein verwendete Zellbehandlungskonzentration und -zeit, die nur als Referenz getestet wird.

Zelle

BRDU-Konzentration (μm)

Inkubationszeit (min)

A549.

40

40

Hela

40

40

NRK-52E.

40

40

Skov3.

80

120

H9C2.

40

40

2. Um die besten experimentellen Ergebnisse zu gewährleisten, wird empfohlen, andere unterstützende Reagenzien von unserem Unternehmen zu verwenden: Hämatoxylinfleck (G1004); DAPI Fleck (G1012); DAB-Farbreagenz-Kit (G1212), Anti-Fluoreszenz-Abschrecktabletten (G1401);

3. Tragen Sie für Ihre Sicherheit und Gesundheit LAB-Mäntel und Einweghandschuhe für den Betrieb.

Das Produkt ist nur für wissenschaftliche Forschungszwecke, nicht für die klinische Diagnose!

G4102-50T.Reagenz -1 (1)downloadimg.Scheibe 12.Scheibe 13.Scheibe 10Scheibe 14.

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