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Click-It EDU-488 Zellproliferations-Erfassungs-Kit

Volumen: 100t.

Verfügbarkeitsstatus:
  • G1601.
  • Servicebio

Produktbeschreibung

Produkteinführung:

Es ist eine übliche und wichtige Bewertungsmethode in den Lebenswissenschaften, um den Einfluss bestimmter Gene, Medikamente usw. auf den in vitro kultivierten Zellen zu bestimmen, indem die Zellproliferationsfähigkeit analysiert oder das Wachstums- und Erneuerungsfähigkeit einzelner Gewebezellen unter anderem analysiert wird Bedingungen oder Stimulationsinterventionen. . Es gibt viele Methoden zum Erkennen der Zellproliferation. Die meisten von ihnen verwenden einige metabolische Enzyme, die von Zellen hergestellt werden, um die Proliferationsaktivität von Zellen (z. B. CCK-8-Verfahren, MTT-Verfahren usw.) indirekt zu bewerten, aber einige Medikamente oder Faktoren wie der Zustand der Zelle selbst werden ein bestimmtes Auswirkungen auf die Ergebnisse der Bewertung. Die direkte Erfassung der DNA-Synthese in Zellen zur Bestimmung der Zellproliferation wird als das genaueste und effektivste Erfassungsverfahren erkannt. Sowohl das ursprüngliche radiolabelisierte Nucleosid-Einbauverfahren als auch die anschließende Verbesserung des BRDU-Verfahrens basierend auf der Antikörpererkennung haben jedoch ihre eigenen Einschränkungen.

EDU (5-ethinyl-2'-deoxyuridin, 5-ethinyl-2'-deoxyuridin) ist ein Thymidinanalogon, der eine Acetylengruppe enthält, wenn er in Tiere oder Inkubierende Zellen injagt, die in vitro kultiviert sind, diese kleinen Moleküle, die in verschiedenen Organen kultiviert sind, schnell diffundieren können und Gewebe und Infiltrieren in Zellen, und können Thymidin (t) während der Zellproliferation in neu synthetisierter DNA ersetzen. Die Acetylengruppe im EDU-Molekül kann mit der fluoreszenzförmig markierten Azidverbindungssonde reagieren, um unter der Katalyse von Kupferionen einen stabilen Triazolring zu bilden, so dass die neu synthetisierte DNA mit der entsprechenden Fluoreszenzsonde markiert werden kann. Im Vergleich zum radiomakelförmigen Nukleosid-Einbauverfahren weist das EDU-Erfassungsverfahren keine limitierenden Faktoren wie radioaktiver Kontamination auf; Im Vergleich zum BRDU-Erfassungsverfahren erfordert das EDU-Erfassungsverfahren keine DNA-Denaturierungsbehandlung oder Antigen-Antikörper-Reaktion, die die Komplexität des Experiments und der Zeit erheblich verringert, sondern auch zeitsparender, empfindlicher, stabiler und genauer . Dieses Kit kann verwendet werden, um die Zellproliferation in kultivierten Zellen oder Tiergewebe in vitro zu erkennen. Die fluoreszierende Sonde in diesem Kit ist eine grüne Fluoreszenz, die maximale Anregungswellenlänge beträgt 491 nm, und die maximale Emissionswellenlänge beträgt 516 nm. Nachdem die proliferierenden Zellen markiert sind, zeigt der Zellkern eine helle grüne Fluoreszenz. Der Zellkern wird gemeinsam mit dem passenden herkömmlichen Kernfärbungsfarbe markiert (dieses Kit bietet HOCHST 33342-Zellkernfärbung), Sie können Fluoreszenzmikroskop, laser konfokales Mikroskop und andere Instrumente verwenden, um die Zellproliferation direkt zu beobachten; Sie können auch eine Fließzytometrie verwenden, um die Fluoreszenzintensität der kultivierten Zellen in vitro zu erkennen und den Zellzyklus auf der Grundlage der Fluoreszenzintensitäts-DNA-Replikationsaktivität in der Mid-S-Phase zu beurteilen.

Lagerung und Transport

In nassem Eis transportiert; bei -20 ° C im dunklen, edu katalytischen Reagens (Reagenz A) und Reaktionspuffer gelagert, kann bei 4 ° C gelagert werden; gültig für 12 Monate.

Komponentennummer

Komponente

G1601-100T.

G1601-1.

EDU-Speicherlösung (10 mm)

100 μl.

G1601-2.

Katalytisches Reagenz (Reagenz A)

120 μl.

G1601-3.

Fluoreszierender Farbstoff IF488 (Reagenz B)

50 μl.

G1601-4.

Katalytische Additive (Reagenz c)

2 × 100 mg (Pulver)

G1601-5.

Reaktionspuffer

20 ml

G1601-6.

Hoechst 33342 Färbungslösung

30 μl.

Produktbenutzerhandbuch

1 stück

Hinweis: Die obigen Reaktionszeiten entsprechen der 96-Well-Plattenerkennung.

Experiment Vorbereitung

1. Zellkulturmedium mit Serum;

2. Permeabilisierungslösung: Pufferlösung mit 0,2-0,5% Triton X-100 (G1204 wird empfohlen);

3. Fixierlösung: 4% Paraformaldehyd (G1101 empfohlen) oder andere Reagenzien zu ähnlichen Zwecken;

4. PBS-Puffer (G4202 wird empfohlen);

5. Ultra-reines Wasser;

6. Tiermodellierungs- und Gewebeabschnitt verwandte Reagenzien (tierische Tissue-Zellen-Proliferations-Erfassung).

Betriebsschritte:

1. Herstellung von In-vitro-Zellproben und Reagenzien:

1.1. Pflanzen Sie die Zellen gleichmäßig in der Zellkulturplatte mit einer bestimmten Dichte (die Pflanzendichte wird durch Faktoren wie Zellengröße, Wachstumsgeschwindigkeit usw. bestimmt). Nachdem die Zellen an der Wand haften oder in einen normalen Zustand zurückkehren, führen Sie die entsprechende Wirkstoffstimulation und andere Behandlungen (z. B. Testsuspensionszellen, führen Sie bitte das normale Betriebsmethode von Suspensionszellen durch, das gesamte Experiment muss Schritte wie Zentrifugation hinzufügen.

1.2. Zentrifugieren Sie das katalytische Additiv (Reagenz c) bei niedriger Geschwindigkeit, fügen Sie 1 ml Reinstallwasser hinzu, um es aufzulösen, und speichern Sie es bei -20 ° C für spätere Verwendung.

2. EDU-Kennzeichnung, Fixierung und Permeabilisierung von Zellen in vitro:

2.1. Bereiten Sie 2 × edu-Inkubations-Arbeitslösung vor: Fügen Sie 2 μl EDU-Speicherlösung (10 mm) zu jedem 1 ml kompletten Zellkulturmedium hinzu, das 20 μm 2 × Edu-Inkubations-Arbeitslösung beträgt, und legen Sie es in den Inkubator, um vorzuwärmen (es ist) empfohlen, das Vor-Experiment mit der EDU-Arbeitskonzentration von 10 μm zu erforschen;

2.2. In der Art von halbwechselndem Medium, saugen die Hälfte des ursprünglichen Zellkulturmediums in der Kulturplatte und fügt ein gleiches Volumen an vorgewärmter 2 × edu-Inkubations-Arbeitslösung hinzu, und inkubieren Sie für einen bestimmten Zeitraum (die Inkubationszeit hängt im Allgemeinen ab) Auf dem entsprechenden Zellwachstum entfallen der Zyklus in der Regel etwa 10% der Zellzykluszeit. Für die meisten anhaftenden und schnell wachsenden Zellen wird empfohlen, etwa 2 Stunden lang zu inkubieren. Für bestimmte Bedingungen muss es entsprechend den eingestellt werden Zelleigenschaften und tatsächliche Bedingungen nach der Behandlung. Wenn eine längere Inkubation erforderlich ist, kann die EDU-Arbeitskonzentration angemessen reduzieren; Für eine kürzere Zeit kann EDU-Konzentration angemessen erhöht werden);

2.3. Nachdem die edu-markierte Zellprobe 1-2-mal mit PBS-Puffer gewaschen wird, fügen Sie die fixative Lösung hinzu, um die Zellen abzudecken, und fixieren Sie 15 Minuten bei Raumtemperatur (wenn die Strömungserkennung erforderlich ist, haften Sie an den Zellen, bevor dieser Schritt nach diesem Schritt nach diesen Schritt ist Verdauung und Resuspension, fixieren Sie es und folgen Sie dem Aufhängungszellenverarbeitungsverfahren); 2-3 mal mit PBS-Puffer waschen, jedes Mal 3-5 min;

2.4. Entfernen Sie den PBS-Puffer, fügen Sie den Permeat hinzu, um die Zellen oder Gewebe abzudecken, und inkubieren Sie 15 Minuten bei Raumtemperatur;

2.5. Waschen Sie nach dem Entfernen des Permeates 1-2-mal mit PBS-Puffer 3-5 Minuten jedes Mal, und gehen Sie dann zu Schritt 4.

3. Animal-EDU-Injektionsmodellierung und -gewebeabschnitt Verarbeitung:

3.1. Gemäß den experimentellen Anforderungen werden eine oder mehrere EDU-Injektionen verwendet, um Tiere durch intraperitoneale Injektion, intramuskuläre Injektion, subkutane Injektion, Schwanzveneeinspritzung usw. zu modellieren. Im Allgemeinen beträgt das Verhältnis von EDU-Dosierung zum tierischen Körpergewicht 5 mg / kg. Spezifische Injektion Der Betrag hängt vom Forschungsgehalt und den Tierbedingungen ab. In diesem Kit ist ein Teil der EDU-Speicherlösung bereitgestellt, der hauptsächlich für die In-vitro-Zell-EDU-Kennzeichnung verwendet wird. Wenn Sie Tiere mit EDU modellieren müssen, können Sie das EDU-Reagenz getrennt bestellen (G5059 wird empfohlen);

3.2. Dünndarm- und andere Epithel-Gewebezellen promuieren sich schnell, und Hirngewebezellen proliferieren langsam. Das schneller wachsende Gewebe dauert normalerweise weniger als 12 Stunden, um zu markieren, während das langsamer wachsende Gewebe mehrere Tage dauern kann, um zu markieren; Die beste Markierungszeit basiert auf dem jeweiligen Experiment, da das kleine Darm-Epithel-Gewebe schnell lehrt, es wird empfohlen, diese Art von Gewebe als Etikettenreferenz zu verwenden;

3.3. Nachdem die modellierten Tiere gemäß den vorgeschriebenen Standards getötet werden, werden die erforderlichen Gewebe herausgenommen, und gefrorene Abschnitte oder Paraffinabschnitte werden nach herkömmlichen Verfahren hergestellt;

A. Für gefrorene Abschnitte: Rückkehr zur Raumtemperatur, fügen Sie eine geeignete Menge an Fixativ hinzu und fixieren Sie 15 Minuten bei Raumtemperatur. Entfernen Sie das Fixiermittel und waschen Sie dreimal mit einer entsprechenden Menge PBS-Puffer für jeweils 3-5 Minuten; Entfernen Sie den PBS-Puffer und bedecken Sie das Gewebe mit einer geeigneten Menge an Permeabilisierungslösung und inkubieren Sie bei Raumtemperatur 10-15 min; Entfernen Sie die Permeabilisierungslösung und waschen Sie 1 mit PBS-Puffer -2-mal, 3-5 Minuten jedes Mal, dann gehen Sie zu Schritt 4.

B. Für Paraffinabschnitte: Deparaffinisieren und rehydrieren Sie die Abschnitte und waschen Sie 5 Minuten mit PBS. Entfernen Sie den PBS-Puffer, fügen Sie den Permeat hinzu, um die Zellen oder Gewebe abzudecken, und inkubieren Sie 15 min bei Raumtemperatur; Waschen Sie nach dem Entfernen des Permeates 1-2-mal mit PBS-Puffer 3-5 Minuten jedes Mal, und gehen Sie dann zu Schritt 4.

4. EDU Klick Antwort:

4.1. Bereiten Sie während der Zelle oder Gewebefixierung und Perforation die Klickreaktionslösung (für verschiedene Probenvorbereitungssysteme auf das Schema in der nachstehenden Tabelle) auf)

Für in vitro kultivierte Zellen: Dieser Bezugsschritt entspricht dem Volumen und der Dosierung von 10 96-Well-Plattenabtastwerten (100 μl pro Vertiefung). Der Vorbereitungsbetrag kann im Verhältnis zu den Anforderungen der Verwendung erhöht oder verringert werden. Bitte fügen Sie die Komponenten in der in der nachstehenden Tabelle angegebenen Reihenfolge hinzu. Seite hinzufügen und gut mischen (aufbereitet und net verwendet);

Komponente

Volumen

Reaktionspuffer

935 μl.

Katalytisches Reagenz (Reagenz A)

10 μl.

Fluoreszierender Farbstoff IF488 (Reagenz B)

5 μl.

Katalytische Additive (Reagenz c)

50 μl.

Gesamtkapazität

1000 μl.

Für Tissue-Zellscheiben: Siehe das folgende System zur Herstellung des Click-Reaktions-Lösungssystems. Die Herstellungsbetrag kann proportional zur Anzahl der Schnittproben erhöht oder reduziert werden. Jede Scheibenprobe ist mit etwa 100-200 μl Click-Reaktionslösung bedeckt.

Komponente

Volumen

Reaktionspuffer

928 μl.

Katalytisches Reagenz (Reagenz A)

10 μl.

Fluoreszierender Farbstoff IF488 (Reagenz B)

12 μl.

Katalytische Additive (Reagenz c)

50 μl.

Gesamtkapazität

1000 μl.

4.2. Entfernen Sie den PBS-Puffer des vorherigen Schritts (Schritt 2.5 oder 3.3), fügen Sie die Click-Reaktionslösung hinzu, schütteln Sie sanft, um sicherzustellen, dass die Reaktionslösung alle Zellen oder Gewebe deckt, und 30 min bei Raumtemperatur in der Dunkelheit inkubieren;

4.3. Entfernen Sie die Click-Reaktionslösung und waschen Sie 2-3-mal mit PBS-Puffer für 3-5 Minuten bei jedem Zeitpunkt (wenn es keine besonderen Anforderungen gibt, können Sie die Fließzytometrie verwenden, um die Fluoreszenzintensität zu erkennen oder andere Instrumente zu verwenden, um den Fluoreszenz-Effekt zu erkennen) .

5. Atomfärbung:

5.1. Entfernen Sie den PBS-Puffer in dem vorherigen Schritt, verdünnen Sie die Färbungslösung von Hoechst 33342 und PBS-Puffer mit einem Verhältnis von 1: 500-1000, fügen Sie die Abdeckzellen hinzu und inkubieren Sie 5 Minuten;

5.2. Entfernen Sie die Färbungslösung von Hoechst 33342 und waschen Sie 2-3 Mal mit PBS-Puffer für jedes Mal 3-5 Minuten.

6. Imaging- und Erkennungsanalyse

Direkt die kultivierten Zellen oder Gewebescheibenproben in ein Fluoreszenzmikroskop oder ein konfokales Mikroskop, um den Anteil der proliferierenden Zellen zu analysieren; Oder sammeln Sie die in vitro kultivierten Zellen und verwenden Sie ein Durchflusszytometer, um die Fluoreszenzintensität zu erfassen (es wird empfohlen, die edu-markierte Zellprobe als negative Steuerung zur Durchflusszytometrieerfassung zu verwenden, und die entsprechende Spannung wird ausgewählt). Gemäß der Fluoreszenzintensität kann die DNA-Replikationsaktivität in der S-Phase des Zellzyklus beurteilt werden. Die entsprechenden spektralen Eigenschaften des Fluoreszenzfarbstoffs IF488 (Reagenz B) in diesem Kit sind EX / EM: 491 nm / 516 nm (grün); Die entsprechenden spektralen Eigenschaften der HOECHST 33342-Färbungslösung sind ex / em: 346 nm / 460 nm (blau).

Anmerkungen:

1. Für in vitro kultivierte Zellen können die spezifische EDU-Konzentration und Inkubationszeit in Abhängigkeit von der Probe und dem Zweck der Forschung angemessen eingestellt werden.

2. Einige Gewebezellen proliferieren sich langsam. Um Faktoren wie schlechte Modellierungseffekte zu beseitigen, wird empfohlen, Gewebeproben mit schnellen Verbreitung als Referenzproben (z. B. Darmgewebe) auszuwählen.

3. Wenn die Hintergrundfarbe zu dunkel ist, kann es durch unzureichendes Waschen im Experiment, zu langer Gewebeprobenfixierzeit und ein restlicher Fixiermittel verursacht werden.

4. EDU katalytisches Additionsreagenz (Reagenz C) ist einfach zu oxidieren. Versuchen Sie, längere Einwirkung der Luft zu vermeiden. Nachdem er in eine wässrige Lösung zubereitet wurde, wird empfohlen, in Aliquot zu lagern; Wenn nach dem Testen die Farbe des edu-katalytischen Additionsreagens leicht ändert, bleibt das Click-Reaktionskatalytisches System das gleiche, das normal vorgehen kann. Wenn es braun erscheint, gibt es an, dass die Komponente abgelaufen ist. Bitte verwerfen Sie es.

5. Bitte tragen Sie während des Betriebslaborschichtens und für Einweghandschuhe.

Dieses Produkt ist nur für wissenschaftliche Forschungszwecke, nicht für die klinische Diagnose!

G1601.Reagenz -1 (1)

downloadimg.Scheibe 13.Scheibe 10Scheibe 12.

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