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Produktkategorie

Anteil an:

DNA-Ligase 2 × In-Fusion-Klonierungsmischung Mix-molekulares Biologie-Reagenz

Spezifikation: 100t.
Verfügbarkeitsstatus:
  • G3350-100T.
  • Servicebio
  • ServiceBio.

Produktbeschreibung

G3350-100T.

Einführung:

2 × In-Fusion-Klonierungsmix können schnell ligieren und mit 2 ~ 3 mehrfachen Fragmenten in den Vektor klonen. Es eignet sich besonders für eine einzelne Fragment-Ligation, und der Wirkungsgrad von 2-3 Fragment-Ligation wird reduziert. Verwenden Sie jedes Verfahren, um den Vektor linearisieren, und führen Sie die Endfolge des linearisierten Vektors an den 5'END des Vorwärts- / Rückwärts-Amplifikationsprimers des in den linearisierten Vektor eingesetzten DNA-Fragments ein, so dass die 5'Und 3's der Das PCR-Amplifikationsprodukt ist jeweils eine Sequenz (15-25 bp), die mit dem Ende des linearisierten Vektors übereinstimmt. Mischen Sie das PCR-Produkt in der 2 × In-Fusion-Klonierungsmischung, indem Sie das PCR-Produkt an beiden Enden des linearisierten Vektors und dem linearisierten Vektor in einem bestimmten Anteil in einem bestimmten Anteil mischen und dann auf Eis (oder in einer Mischung aus Eis und Wasser) inkubieren. Für 5 Minuten können Sie kompetente Zellen umwandeln und Richtungsklonierung abschließen.

Diese Vormischung kann ein effizientes und schnelles DNA-Nahtloses Klonen erreichen. Und kann für den Aufbau von rekombinanten Plasmiden oder der Genpost-Mutation-rekombinanten Plasmide verwendet werden. Die Vormischung hängt nicht von dem Ligase-System ab, wodurch der Hintergrund der Self-Ligation, und gleichzeitig ist es nicht, die in der Einlage selbst enthaltenen Restriktionsendonuklease-Sites nicht berücksichtigen. Für den Bau von eingment-Segment-DNA-rekombinanten Plasmiden beträgt der Anteil der mit dieser Vormischung erhaltenen positiven Klone bis zu 99%. Die Verwendung dieser Vormischung verlassen sich nicht auf konstante Temperaturgeräte, und alle Vorgänge von der DNA-Probenvorbereitung auf die Umwandlung und das Plattieren von rekombinanten Produkten können innerhalb weniger Stunden abgeschlossen werden, was die Zeit erheblich spart.

Lagerung und Transport

Transport mit nassem Eis; Lagerung bei -20 ° C, gültig für 12 Monate.

Komponente

G3350-10T.

G3350-20T.

G3350-100T.

2 × In-Fusion-Klonierungsmischung

50 μl.

100 μl.

5 × 100 μl

PUC19 (linearisierter, Steuerungsvektor, 5 ng / μl)

-

10 μl.

10 μl.

Steuereinsatz (10 ng / μl)

-

10 μl.

10 μl.

Benutzerhandbuch

1

Reaktionssystem (empfohlenes 10 μl-Reaktionssystem)

Komponente

Volumen

2 × In-Fusion-Klonierungsmischung

5 μl.

Vektor

X μl.

DNA-Segment

Y μl.

Nuklease-freies Wasser

Hinzufügen zu 10 μl

Reaktionsbedingungen

Eiswasserbad (Eiswasser-Mischung), reagieren 5-10 min.


Reaktionsproduktumwandlung.

1. Entfernen Sie kompetente Zellen (wie e.coli dh5α, e.coli top10 usw.) vom Kühlschrank bei -80 ° C und tauen Sie sie auf Eis auf.

2. Fügen Sie die umgesetzte Probe in den kompetenten Zustand hinzu, bewegen Sie den Boden der Röhre sanft mit den Fingern, um 30 Minuten zu mischen und in Eis zu baden.

3. Das Produkt wird dann in einem 42 ° C-Wasserbad eingesetzt, um 90 Sekunden lang zu wärmen. Nach der Fertigstellung wird es schnell auf Eis platziert und 2-5 Minuten in Eis gebadet.

4. Nehmen Sie 900 μl sterile SOC oder LB-Medium und fügen Sie es dem EP-Röhrchen hinzu. Legen Sie nach dem Mischen das EP-Röhrchen auf einen Schüttler und inkubieren Sie 1 Stunde bei 37 ° C bei 220 U / min bei 37 ° C, um die Bakterien wiederherzustellen (sie kann auch in einem 37 ° C-Inkubator für die statische Platzkultur für 1 h) aufgesetzt werden;

5. Zeichnen Sie nach den experimentellen Anforderungen verschiedene Volumina transformierter kompetenter Zellen und fügen Sie sie dem LB-Festmedium hinzu, das die entsprechenden Antibiotika enthält, verteilt die Zellen gleichmäßig, und nachdem die Flüssigkeit vollständig absorbiert ist, platzieren Sie die Platte in einem 37 ° C auf den Kopf Inkubator und kultivieren Sie über Nacht.

Identifizierung positiver Klone

Die auf der Platte angebauten monoklonalen Kolonien werden zur Kolonie-PCR-Identifizierung ausgewählt, oder nach der Kultur wird das Plasmid durch die Einschränkungsverdauung oder die PCR-Identifizierung extrahiert, oder das extrahierte Plasmid wird direkt sequenziert und zur Identifizierung analysiert.

Vorsichtsmaßnahmen

1. Der Vektor- und Zielfragment muss durch Gel und Elektrophorese gereinigt werden, um ihre Qualität und Konzentration zu erkennen. Wenn die Konzentration niedrig ist, ist es nicht notwendig, Wasser hinzuzufügen, und nutzen Sie es direkt, um sie auszuschließen.

Der TM-Wert zwischen den überlappenden Bereiche mehrerer Fragmente muss konsistent und> 60 ° C sein.

3. Es wird empfohlen, das Molverhältnis von Vektor zum Einsatz 1: 1 ~ 1: 3 beträgt; Wenn 2-3 Fragmente miteinander verbunden sind, beträgt das Molverhältnis zwischen jedem Fragment 1: 1, und der Ligationswirkungsgrad von 2-3 Fragmenten wird reduziert. Das Ligationsreaktionssystem kann in gleichen Proportionen skaliert werden. .

4. Wenn das Gesamtvolumen des Vektors und des Einsatzes größer als 5 μl ist, kann das Reaktionssystem auf 20 μl verstärkt werden.

5. Das Volumen des Ligationsprodukts sollte 1/10 des Volumens der zuständigen Zelle nicht überschreiten, andernfalls wird die Transformationseffizienz erheblich reduziert. Das Volumen des Ligationsprodukts und der kompetenten Zelle kann in demselben Anteil erhöht werden (z. B. 20 μl des Ligationssystems, um 200 μl kompetente Zellen umzuwandeln).

6. 2 × In-Fusion-Klonierungsmix wird empfohlen, wenn Sie nach dem Gebrauch auf -20 ° C zurückgenommen werden. Nach dem Auftauen kann es in Pakete unterteilt und eingefroren, um wiederholte Gefrier- und Auftauungszeiten zu reduzieren.

7. Wenn die Elektroporation zur Transformation verwendet wird, muss das Reaktionsprodukt durch Säulenverfahren oder Ethanol-Fällungsmethode gereinigt werden.

G3350-100T.downloadimg.Scheibe 12.Scheibe 13.Scheibe 10Scheibe 14.

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