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DNA-Ligase 2 x Universal-Ligationsmix mit T4-DNA-Ligase und Puffermolekularbiologie-Reagens

Spezifikation: 100t.
Verfügbarkeitsstatus:
  • G3341-100.
  • Servicebio
  • ServiceBio.

Produktbeschreibung

G3341-100.

Beschreibung:

2 × Universal-Ligationsmix ist eine gebrauchsfertige 2 × Vormischung, die T4-DNA-Ligase und Reaktionspuffer enthält. Die enthaltene T4-DNA-Ligase kann die 5'-P und 3'''-DNA- oder RNA mit stumpfend beendeten doppelsträngigen DNA katalysieren. Die -OH-Enden werden mit Phosphodiester-Bindungen kombiniert. und kann einzelsträngige Nicks in doppelsträngigen DNA-, RNA-, RNA- und DNA / RNA-Hybridketten reparieren. Der optimierte vorgemischte Reaktionspuffer macht die Reaktion effizienter und bequemer zu handhaben. Das Reaktionssystem kann eine Vielzahl chemisch kompetenter Zellen nach dem Umsetzen bei 25 ° C für 5 Minuten umwandeln.

Lagerung und Transport

Transport mit nassem Eis; Lagerung bei -20 ° C, gültig für 12 Monate.

Komponente

G3341-50.

G3341-100.

2 × Universal Ligation Mix

250 μl.

2 × 250 μl

Verbindungssystem (empfohlenes 10 μl-Reaktionssystem)

Komponente

Volumen

2 × Universal Ligation Mix

5 μl.

Vektor

X μl.

DNA-Segment

Y μl.

Nuklease-freies Wasser

Hinzufügen zu 10 μl

Ligationsreaktionsbedingungen.

Die Ligationsreaktion des klebrigen Ende bei 25 ° C beträgt 5-30 Minuten, und die Ligationsreaktion des stumpfen Endes bei 25 ° C überschreitet 2 Stunden oder die Reaktion bei 4 ° C über Nacht.

Umwandlung von Ligationsprodukten

1. Entfernen Sie kompetente Zellen (wie E. coli dh5α, e.coli top10 usw.) vom Kühlschrank bei -80 ° C und taue sie auf Eis;

2. Fügen Sie die umgesetzte Probe in den kompetenten Zustand hinzu, bewegen Sie den Boden der Röhre sanft mit den Fingern, um gut zu mischen, und das Eisbad 30 Minuten;

Das Produkt wird dann in einem 42 ° C-Wasserbad für 90 s zum Erwärmen von Stoßdämmen angeordnet, und danach wird es für 2-5 Minuten schnell auf Eis gelegt;

4. Nehmen Sie 900 μl sterile SOC oder LB-Medium und fügen Sie es dem EP-Röhrchen hinzu. Legen Sie nach dem Mischen das EP-Röhrchen auf einen Schüttler und inkubieren Sie 1 Stunde bei 37 ° C bei 220 U / min bei 37 ° C, um die Bakterien wiederherzustellen (sie kann auch in einem 37 ° C-Inkubator für die statische Platzkultur für 1 h) aufgesetzt werden;

5. Zeichnen Sie nach den experimentellen Anforderungen verschiedene Volumina transformierter kompetenter Zellen und fügen Sie sie dem LB-Festmedium hinzu, das die entsprechenden Antibiotika enthält, verteilt die Zellen gleichmäßig, und nachdem die Flüssigkeit vollständig absorbiert ist, platzieren Sie die Platte in einem 37 ° C auf den Kopf Inkubator und kultivieren Sie über Nacht.

Identifizierung positiver Klone

Die auf der Platte angebauten monoklonalen Kolonien werden zur Kolonie-PCR-Identifizierung ausgewählt, oder nach der Kultur wird das Plasmid durch die Einschränkungsverdauung oder die PCR-Identifizierung extrahiert, oder das extrahierte Plasmid wird direkt sequenziert und zur Identifizierung analysiert.

Vorsichtsmaßnahmen

1. Es wird empfohlen, das Reaktionssystem auf Eis zu konfigurieren.

2. Die Vektor- und Zielfragmente müssen gel gereinigt und Elektrophorese sein, um ihre Qualität und Konzentration zu erkennen. Wenn die Konzentration niedrig ist, können Sie sie direkt verwenden, um ohne Wasser hinzuzufügen. Wenn das Gesamtvolumen des Vektors und des Einsatzes größer als 5 μl ist, kann das Reaktionssystem auf 20 μl verstärkt werden.

3. Es wird empfohlen, das Molverhältnis von Vektor zum Einsatz 1: 3 ~ 1: 10 beträgt.

4. Wenn die Elektroporation zur Umwandlung verwendet wird, muss das Ligationsprodukt durch Säulenverfahren oder Ethanol-Fällungsmethode gereinigt werden.

5. 2 × Universal-Ligation-Mix wird empfohlen, wenn Sie nach dem Gebrauch sofort auf -20 ° C zurückgegeben werden. Nach dem Auftauen kann es verpackt und eingefroren werden, um die Anzahl der wiederholten Freeze-Tau-Zyklen zu reduzieren.

6. Beim Anschluss eines stumpfenden Vektors in ein DNA-Fragment muss der Vektor dephosphoryliert sein (G3400 empfohlen), um seine Selbstkreislauf zu verhindern.

7. Bitte tragen Sie während des Betriebs Laborkleidung und Einweghandschuhe.

G3341-100.downloadimg.Scheibe 10Scheibe 12.Scheibe 13.

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