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Anteil an:

PSWE-TOPO ZERO CLONING KIT FÜR DNA-Anschluss Molekularbiologie Reagens

Spezifikation: 25T.
Verfügbarkeitsstatus:
  • G3022-25T.
  • Servicebio
  • ServiceBio.

Produktbeschreibung

G3022-25T.

Einführung:

Das von unserer Firma produzierte PSWE-TOPO-Zero-Kloning-Kit ist ein Vektor zum Screening positiver Rekombinanten durch den Expression von Selbstmordgenen und wird vom PUC19-Vektor modifiziert. Wenn das Ziel-Genfragment nicht mit dem Vektor verbunden ist, wird das Selbstmordgen erfolgreich und richtig ausgedrückt, und die Zellen, die den Vektor enthalten, können nicht wachsen; Wenn das Ziel-Genfragment erfolgreich mit dem Vektor verbunden ist, wird das Selbstmordgen nicht ordnungsgemäß ausgedrückt, und die Zellen, die den Vektor enthielten, können normal wachsen. Dieser Vektor wird auch als Hintergrundvektor \"Null \" genannt. Gleichzeitig verwendet das PSWE-Topo-Zero-Kloning-Kit unseres Unternehmens eine neue Vektor-Ligationsmethode, es ist kein zusätzliches Ligase erforderlich, um das Fragment an den Vektor anzuschließen, nur das Ziel-Genfragment muss dem Vektor bei Raumtemperatur (22) zugesetzt werden ℃ -37 ℃) Der Umwandlungsvorgang kann nach dem Umsetzen von 5 Minuten durchgeführt werden. PSWE-TOPO ZERO CLONING KIT ist mit TA CLONING und STOUND-END-Klonen kompatibel.

Eigenschaften: Einfach zu bedienen, kompatibel mit dem TA-Klonen und stumpfendem Klonen; Es ist keine zusätzliche Enzymreaktion erforderlich, das Zielgen-Fragment wird dem System zugesetzt, und die normale Umwandlung kann innerhalb von 5 Minuten bei Raumtemperatur durchgeführt werden; Die positive Rate kann 95% erreichen; kurze und lange Fragmente für das Klonen; Selektionsmarker ist Ampicillin; Sequenzierung Primer: M13 Vorwärtsprimer, M13 Reverse Primer.

Lagerung und Transport

Transport mit nassem Eis; Lagerung bei -20 ° C, gültig für 12 Monate.

Komponentennummer

Komponente

G3022-25T.

G3022-1.

PSWE-Topo Null-Vektor (50 ng / μl)

25 μl.

G3022-2.

Steuervorlage (700 bp, 50 ng / μl)

10 μl.

G3022-3.

M13 Vorwärtsprimer (10 μm)

50 μl.

G3022-4.

M13 Reverse Primer (10 μm)

50 μl.

Handbuch

1

Schritte

1. Vorbereitung von PCR-Produkten

(1) Primer können nicht phosphoryliert werden; (2) High-Fidelity- und TAQ-DNA-Polymerase können für PCR-Reaktionen verwendet werden; (3) Es wird empfohlen, Gelwiederherstellungs-Kits zur Reinigung von PCR-Produkten nach der Elektrophorese zu verwenden.

2. Referenzreaktionssystem:

Komponente

Volumen

PSWE-Topo Null-Vektor (50 ng / μl)

1 μl.

Genfragment

0,5-4 μl.

Empfohlene Dosierung des Einsatzes: Das Molverhältnis von Vektor zu Fragment = 1: 10-1: 3. Es kann grob berechnet werden, indem 50 ng 1 KB-Fragment hinzugefügt werden. Wenn die Genbibliothek aufgebaut ist, kann das Reaktionssystem entsprechend erweitert werden.

3. Mischen Sie den Vektor- und Genfragmenten leicht gemäß dem obigen Referenzreaktionssystem, reagieren Sie 5-10 Minuten bei Raumtemperatur (20-37 ° C) und legen Sie das Zentrifugenröhrchen auf Eis.

4. Transformation: a. Fügen Sie einen 50-100 μl-Klon kompetent (oder fügen Sie das Reaktionsprodukt auf 50-100 μl-Klon kompetent hinzu), mischen Sie sanft und Eisbad für 30 Minuten; b, sofort den Systemheizstoß auf 42 ° C für 45 s umzuwandeln, sofort auf Eis 2-3 min auf Eis legen; C, fügen Sie 200 μl SOC- oder LB-Medium, das auf Raumtemperatur in das Transformationssystem äquilibriert wird, und inkubieren Sie bei 200 U / min und 37 ° C für 1 h; D, dauert 200 μl die bakterielle Lösung auf einer resistenten Platte und drückt sie über Nacht bei 37 ° C zurück (um mehr Klone zu erhalten, können Sie einen Teil des Überstands nach der Zentrifugation entfernen und die bakterielle Lösung auf der resistenten Platte ausbreiten).

5. Erkennung positiver Transformanten:

A. Kolonie-PCR-Identifizierung von positiven Klonen: Wählen Sie einen einzelnen Klon in 10 μl steriles Wasser, Wirbel, um zu mischen, dann 1 μl der Mischung als PCR-Vorlage, und dann 1 μl der Mischung als PCR-Vorlage, und M13-Vorwärtsprimer und M13-REVERT-Primer als Universal-Primer, um positive Klone zu identifizieren Kolonie-PCR. (Empfehlen Sie G3304 und G3305; Siehe das entsprechende Produkthandbuch für das PCR-Reaktionssystem und -verfahren sowie PCR-amplifizierte Fragmente positiver Klonen> 100 bp)

B. Identifizierung positiver Klone nach Restriktionsenzym-Verdauung: Wählen Sie einen einzelnen Klon aus und inokulieren sie in einer angemessenen Menge an resistenten flüssigem Medium und kultivieren Sie sie über Nacht bei 220 U / min und 37 ° C. Eine kleine Menge Plasmid wurde extrahiert, mit geeigneten Restriktionsenzymen verdaut, und positive Klone wurden durch Gelelektrophorese identifiziert.

C. Sequenzierung zur Identifizierung positiver Klonen: Verwenden Sie M13-Vorwärtsprimer- und M13-Reverse-Primer-Primer für Sequenzierung und Analyse.

Vorsichtsmaßnahmen

1. Bei Verwendung des Produkts ist es ratsam, das Produkt in einer Eisbox oder in einem Eisbad zu speichern und sofort nach der Verwendung bei -20 ° C zu speichern.

2. E. coli-Stämme DB3.1, CCDB-Überleben, stabil, JM109, XL1-Blau und XL10-Gold, können diese Stämme CCDB tolerieren und können verwendet werden, um CCDB-enthaltende Plasmide zu verbreiten oder zu speichern, sodass der PSWE-Topo-Zero-Vektor so ist nicht anwendbar zum Filter. Kompetente Zellen von Escherichia coli, die nicht tolerant für CCDB, wie DH5α, Top10, TG1, die in anderen Laboratorien üblicherweise verwendet werden, sind anwendbar.

3. Tragen Sie für Ihre Sicherheit und Gesundheit LAB-Mäntel und Einweghandschuhe für den Betrieb.

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