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Anteil an:

T4-DNA-Ligase 5 U / μl für DNA-Anschluss-Molekularbiologie-Reagens

Spezifikation: 500U.
Verfügbarkeitsstatus:
  • G3340-100.
  • Servicebio
  • ServiceBio.

Produktbeschreibung

G3340-100.

Einführung:

T4-DNA-Ligase kann das Binden von klebriger oder stumpfes doppelsträngiger DNA oder RNA zwischen dem 5'-P-Ende und dem 3'-OH-Ende mit einer Phosphodiester-Bindung katalysieren. Gleichzeitig kann das Enzym einzige, einsträngige Nicks in doppelsträngigen DNA-, RNA-, RNA- und DNA / RNA-Hybridketten reparieren.

Aktivitätsdefinition: Eine Einheit des Enzyms kann 1 Nmol mit 32P-markiertem Pyrophosphat in ATP durch Verschiebungsreaktion innerhalb von 20 Minuten bei 37 ° C katalysieren (eine Einheit entspricht etwa 200 Sticky-End-Befestigungseinheiten).

T4-DNA-Ligase. Speicherpuffer:20 mm Tris-HCl (pH 7,5), 50 mm KCl, 1 mm DTT, 50% (v / v) Glycerin.

5 × T4-DNA-Ligase-Puffer:250 mm Tris-HCl (pH 7,6), 50 mm MgCl2, 5 mm ATP, 5 mm DTT, Enhancer.

Lagerung und Transport

Transport mit nassem Eis; Lagerung bei -20 ° C, gültig für 12 Monate.

Komponentennummer

Komponente

G3340-50.

G3340-100.

G3340-1.

T4-DNA-Ligase.

250 u (50 μl)

500 u (100 μl)

G3340-2.

5 × T4-DNA-Ligase-Puffer

1 ml

2 × 1 ml

Benutzerhandbuch

1

Ligationsreaktionsbedingungen.

Die Ligationsreaktion bei 25 ° C für klebrige Enden dauert 5-30 Minuten; Die Ligationsreaktion bei 25 ° C für stumpfen Enden überschreitet nicht 2 Stunden oder die Reaktion bei 4 ° C über Nacht.

Umwandlung von Ligationsprodukten

1. Nehmen Sie kompetente Zellen (wie E.Coli DH5α, E.Coli Top10 usw.) vom -80 ℃ Kühlschrank aus und legen Sie sie auf das Tauen auf Eis;

2. Fügen Sie die umgesetzte Probe mit dem kompetenten Zustand hinzu, bewegen Sie den Boden der Röhre sanft mit den Fingern, um 30 Minuten zu mischen und in Eis zu baden;

3. Stellen Sie dann das Produkt dann in ein 42 ℃ Wasserbad, um 90 s zu heizen. Nachdem es vorbei ist, platzieren Sie es schnell auf Eis auf Eis für 2-5 Minuten in einem Eisbad;

4. Nehmen Sie 900 μl sterile SOC oder LB-Medium und fügen Sie es dem EP-Röhrchen hinzu. Legen Sie nach dem Mischen das EP-Röhrchen auf einen Schüttler und inkubieren Sie 1 Stunde bei 220 U / min bei 37 ° C, um die Bakterien wiederzubeleben (sie kann auch in einem 37 ° C-Inkubator platziert werden. Platzieren Sie die Kultur für 1 h);

5. Zeichnen Sie nach den experimentellen Anforderungen verschiedene Volumina transformierte kompetente Zellen und fügen Sie sie dem LB-Festmedium hinzu, das die entsprechenden Antibiotika enthält, die Zellen gleichmäßig ausbreiten, und nachdem die Flüssigkeit vollständig absorbiert ist, platzieren Sie die Platte in den 37 ° nach oben C Inkubator und kultivieren Sie über Nacht.

Identifizierung positiver Klone

Die auf der Platte angebauten monoklonalen Kolonien werden zur Kolonie-PCR-Identifizierung ausgewählt, oder nach der Kultur wird das Plasmid durch die Einschränkungsverdauung oder die PCR-Identifizierung extrahiert, oder das extrahierte Plasmid wird direkt sequenziert und zur Identifizierung analysiert.

Vorsichtsmaßnahmen

1. Es wird empfohlen, das Reaktionssystem auf Eis zu konfigurieren.

2. Wenn die Konzentration des Vektors und des Zielfragments niedrig ist, ist es nicht notwendig, Wasser hinzuzufügen, und nutzen Sie es direkt, um sie auszuschließen.

Es wird empfohlen, dass das Molverhältnis von Vektor-DNA zum eingelegten DNA-Fragment 1: 3 ~ 1: 10 beträgt.

4. Eine kleine Niederschlagsmenge in dem 5 × T4-DNA-Ligase-Puffer ist normal. Es kann bei 37 ° C vor dem Experiment gelöst werden, und es wird nach gründlichem Mischen verwendet. Es hat keinen Einfluss auf das Experiment; Es wird empfohlen, sich in Aliquots aufzulösen und zur Verwendung zu fräsen.

5. Die T4-DNA-Ligase wird empfohlen, wenn Sie nach dem Gebrauch auf -20 ℃ zurückgesetzt werden.

6. Wenn die Elektroporation zur Transformation verwendet wird, muss das Ligationsprodukt durch Säulenverfahren oder Ethanol-Fällungsmethode gereinigt werden.

7. Beim Anschließen des stumpfenden Vektors in das DNA-Fragment muss der Vektor dephosphoryliert sein (G3400 wird empfohlen), um die Selbstzirkularisation zu verhindern.

8. Bitte tragen Sie während des Betriebs Laborkantel und Einweghandschuhe.

G3340-1004.G3340-100O.

downloadimg.Scheibe 10Scheibe 13.Scheibe 12.Scheibe 14.

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