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Anteil an:

T7 Hochleistungs-Transkription-Kit für RNA-Synthese

Spezifikation: 50t.
Verfügbarkeitsstatus:
  • G3021-50T.
  • Servicebio
  • ServiceBio.

Produktbeschreibung

G3021-50T.

Produkteinführung

Dieses Kit verwendet T7-RNA-Polymerase, um ein linearisiertes Plasmid-DNA, ein PCR-Produkt oder synthetische DNA, das einen T7-Promotor enthält, zudet, und die Synthese von RNA wird in vitro transkribiert. Dieses Kit optimiert das RNA in vitro transkriptionales Reaktionssystem, das einfach schnell eine große Anzahl von RNA-Molekülen erhalten kann. Wenn das modifizierte Nukleotid in dem Substrat zugegeben wird, kann das reaktive Nukleotid hergestellt werden, und RNA-markierte RNA kann hergestellt werden. Dieses Kit wird hauptsächlich in der In-vitro-Übersetzung, dem RNase-Schutz-Experiment, des Hybridsonden-Tags, der RNA-Schere und anderer biologischer Experimente verwendet. Ein Vorlageeintrag von 1 μg in das Reaktionssystem kann eine RNA mit einer RNA als 100 μg erzeugen, die zur Herstellung von RNA-Länge 100 bis 5000 NT geeignet ist.

Lagerung und Transport

Transport mit nassem Eis; Lagerung bei -20 ° C, gültig für 12 Monate.

Schritte

1. Vorlagevorbereitung:

A. Verwenden Sie das Plasmid des T7-Promotors als Vorlage: Um RNA einer spezifischen Länge zu erhalten, muss die Plasmidvorlage vollständig linearisiert sein (es muss als Vorlage gereinigt werden), und das linearisierte Plasmid sollte sicherstellen, dass die doppelten Stränge sind stumpfe Enden oder 5'overhangs (vermeiden Sie 3'''EVerhangs), der empfohlene Templatbetrag für jede Reaktion beträgt 1 μg;

B. Verwenden Sie das PCR-Produkt des T7-Promotors oder das synthetisierte DNA-Fragment als Vorlage: Wenn die PCR ampliziert, dass die Vorlage den T7-Promotor (5'-taatacgactcactataggg-3 ') an den 5'END des nicht-codierenden Strangprimers hinzufügen. PCR-Produkte können direkt als Transkriptionsvorlagen ohne Reinigung verwendet werden, aber nach der Reinigung wird mehr RNA erzeugt. Die empfohlene Templatmenge für jede Reaktion beträgt etwa 0,5 μg.

2. Transkriptionsreaktion: Fügen Sie gemäß dem empfohlenen Reaktionssystem in der Tabelle verschiedene Reagenzien in den sauberen EP-Röhrchen hinzu, mischen Sie gut und reagieren Sie 2 Stunden bei 37 ° C. (Wenn Sie RNA weniger als 300 NT synthetisieren, wird empfohlen, die Reaktionszeit auf 4 h oder länger zu verlängern).

Komponente

Volumen

Schablone

0,5-1 μg

5 × T7-Transkriptionsreaktionspuffer

4 μl.

25 mm NTP-Mix

2 μl.

T7 RNA-Transkription-Enzym-Mix

4 μl.

Nuklease freies Wasser

Bis 20 μl.

3. Nachdem die Reaktion abgeschlossen ist, fügen Sie 1 μl DNase I an das System hinzu und reagieren Sie 15 Minuten bei 37 ° C, um die transkribierte DNA-Vorlage zu verdauen.

4. Die synthetisierte RNA kann in nachgelagerten Experimenten nach der Elektrophoreseanalyse und -reinigung verwendet werden.

5. Quantifizierung und Erkennung von Transkriptionsprodukten: Die Konzentration von RNA kann durch ultraviolettes Absorptionsverfahren bestimmt werden (freie Nukleotide wirken sich auf die Genauigkeit der Quantifizierung aus, RNA-Produkte müssen gereinigt); Die Elektrophoreseerkennung wird empfohlen, um 1% iger Formaldehyd-Agarose-Denaturiergelanzung zu verwenden, Elektrophorese-Lösung ist 1 × MOPS-Puffer (10 × MOPS-Puffer: 0,4 M MOPS, pH 7,0, 0,1 M Natriumacetat, 10 mm EDTA). GEL-Zubereitungsmethode: Wiegen Sie 0,5 g Agarose in 36 ml RNase-freies Wasser, Wärme, um zu schmelzen, und fügen Sie 5 ml 10 × MOPS-Puffer hinzu. Wenn die Lösung nicht heiß gekühlt wird, fügen Sie 9 ml Formaldehydelösung (37%) hinzu, mischen Sie gut und gießen Sie den Kleber. Bei der Elektrophoreseerkennung mischen Sie eine geeignete RNA-Menge an RNA mit RNA-Ladepuffer, inkubieren Sie 10 Minuten lang bei 70 ° C, dann das Eisbad für 2 Minuten, und erkennen Sie alle Proben. Flecken nach der Elektrophorese mit EB oder Abstand (G3606) zur Beobachtung.

Vorsichtsmaßnahmen

1. Die Oberfläche der menschlichen Haut ist reich an RNase. Bitte tragen Sie experimentelle Handschuhe und Masken beim Experimentieren. Die experimentellen Verbrauchsmaterialien sind steril und enzymfrei, um die Kontamination von RNase zu verhindern.

2. Wenn Sie markierte RNA vorbereiten müssen, ersetzen Sie bitte den NTP-Mix in das Kit.

3. Die Transkriptionslänge der Steuervorlage im Kit beträgt 500 NT.

4. Tragen Sie für Ihre Sicherheit und Gesundheit Labormäntel und Einweghandschuhe für den Betrieb.

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