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Anteil an:

TMR Red Tunel Zell Apoptose Erkennungskit für Paraffinabschnitt Gefrorene Gewebeabschnitt Zellen Slide Zellenabstrich

Volumen: 5.0t.

Verfügbarkeitsstatus:
  • G1502-50T.
  • Servicebio
  • ServiceBio.

Produktbeschreibung

Produktinformation:

Produktname

Katze. Nein.

Volumen

TMR (rot) Tunel-Zell-Apoptose-Erkennungskit

G1502-50T.

50t.

G1502-100T.

100t Jahre

Produktbeschreibung:

Der Bruch der chromosomalen DNA in Apoptose ist ein allmählicher Prozess. Chromosomale DNA wird zuerst unter der Wirkung endogener Nukleasen in große Fragmente von 50 bis 300 Kb und dann etwa 30% der chromosomalen DNA unter der Wirkung von Ca2 +- und Mg2 + -Drender Endonukleasen. Sie werden zufällig zu 180-200 bp nukleosomalem DNA-Polymer geschnitten. Daher wird DNA in der späten Stufe der Apoptose in 180-200 BP-Fragmente abgebaut, und eine große Anzahl von 3'-OH-Enden wird auf der gebrochenen genomischen DNA freigelegt. Terminal Desoxynukleotidyltransferase (TDT) ist eine vorlagenunabhängige DNA-Polymerase, die die Bindung von Desoxynukleotiden an den 3'-OH-Enden von gebrochenen DNA-Molekülen katalysieren kann. Daher kann Tunel (TDT vermittelte DUTP Nick End-Kennzeichnung) Zell-Apoptose-Erkennungsset verwendet werden, um den nuklearen DNA-Bruch von Gewebezellen in der späten Bühne der Apoptose zu erkennen. Das Prinzip ist, dass unter der Wirkung des TDT-Enzyms Tetramethyl-Rhodamin-dubp (Tetramethyl-Rhodamin-5-dubp, TMR-5-doll) in das 3'-OH-Ende eingebaut wird, das ausgesetzt ist, wenn genomische DNA gebrochen ist, damit Kann mit einem Fluoreszenzmikroskop oder einem Durchflusszytometer (TMR-Erregung 520-560 nm, Emission 570-620 nm) erkennen. Dieses Kit hat eine breite Palette von Anwendungen und eignet sich für den Nachweis der Zellapoptose in Paraffingewebeabschnitten, gefrorenen Gewebeabschnitten, Zellrutschen, Zellenabstrichen usw.

Lagerung und Transport

Transport von Eisbeutel (Nasseis);

Dieses Kit wird bei -20 ° C gelagert. TMR-5-DUTP-Kennzeichnungsmischung sollte in der Dunkelheit bei -20 ° C gelagert werden. Die Gültigkeitsdauer beträgt 12 Monate.

Komponente:

Komponentennummer

Komponente

G1502-50T.

G1502-100T.

G1502-1.

Rekombinantes TDT-Enzym.

50 μl.

2 × 50 μl

G1502-2.

TMR-5-DUTP-Kennzeichnungsmix

250 μl.

2 × 250 μl

G1502-3.

Äquilibrierungspuffer

5 × 1 ml

10 × 1 ml

G1502-4.

Proteinase K (200 μg / ml)

1 ml

2 × 1 ml

Produktbenutzerhandbuch

1 stück

Vorbereitung vor dem Experiment:

1. PBS-Phosphatpuffer (G0002 oder G4202 wird empfohlen);

2. Befestigungslösung: 4% Paraformaldehyd, gelöst in PBS oder einem anderen Puffersystem, pH 7,4 (G1101 wird empfohlen);

3. Membranbrechungslösung: 0,1% Triton X-100, gelöst in 0,1% Natriumcitrat (G1204 wird empfohlen);

4. Bereiten Sie PBS, die 0,2% Triton X-100 enthalten; PBS, die 0,1% Triton X-100 und 5 mg / ml BSA enthielt, herstellen;

5. Bei der Kernfärbung müssen Sie Ihre eigenen DAPI (2 μg / ml) oder Pi (1 μg / ml) (G1012, G1021) mitbringen.

6. Wenn Sie ein positives Kontroll-Experiment benötigen, müssen Sie Ihre eigene DNase-I (G3342 empfohlen) mitbringen.

7. Wenn Sie ein Fließzytometer verwenden, bereiten Sie Ihren eigenen PI-Fleck (G1021 empfohlen) vor (G1021 empfohlen) und RNase A (dnasefrei) (G3413 empfohlen);

8. Bitte tragen Sie während des Betriebs Laborkantel und Einweghandschuhe.

Betriebsschritte:

I. Probenvorbereitung.

A. Paraffin-eingebettete Gewebeabschnitte

1. Tränken Sie den Paraffin-Gewebeabschnitt in Xylol bei Raumtemperatur 5-10 min, wiederholen Sie 2-3 Mal; Dann in absolutes Ethanol 5 min einweichen, zweimal wiederholen; Verwenden Sie schließlich Gradientethanol (85%, 75%, doppelte Dampf) Wasser), jedes Mal einmal, jedes Mal 5 min;

2. Spülen Sie den Abschnitt vorsichtig mit PBS und entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit um die Probe. Verwenden Sie einen histochemischen Stift, um einen kleinen Kreis mit einem Abstand von 2-3 mm vom Gewebe entlang der Außenkontur des Gewebes zu zeichnen, um die stromabwärtige Permeabilitätsabwicklung und die Ausgleichsmarkierungsvorgänge zu erleichtern; Lassen Sie das Probe während des Experiments trocken, und legen Sie die verarbeitete Probe in eine feuchte Box, um die Probe feucht zu halten.

3. Bereiten Sie die Proteinase K-Arbeitslösung her: Verdünne Proteinase K (200 μg / ml) Die Letzlösung mit PBS als das Verdünnungsmittel in einem Verhältnis von 1: 9, um die Endkonzentration von 20 μg / ml herzustellen;

4. Fügen Sie 100 μl der oben genannten Proteinase-K-Arbeitslösung zu jeder Probe hinzu, um es alles abgedeckt zu machen, und inkubieren Sie 20 min bei 37 ° C;

(Hinweis: Die Behandlung von Proteinase K ist hauptsächlich für die Permeation von Färbungsreagenzien in den nachfolgenden Schritten von Geweben und Zellen hilfreich. Eine zu lange oder kurze Inkubationszeit wirkt sich auf die anschließende Kennzeichnungseffizienz aus. Um eine bessere Ergebnisse zu erzielen, ist die Inkubationszeit der Proteinase K kann optimiert werden)

5. Infiltrieren und Reinigen Sie die Probe mit einer PBS-Lösung 3-mal, 5 Minuten, jedes Mal (Proteinase k muss sauber gewaschen werden, andernfalls stört es die anschließende Kennzeichnungsreaktion) und platzieren Sie die verarbeitete Probe in einem feuchten Kasten, um die Probe zu halten feucht;

(Optionaler Schritt) Entfernen Sie die überschüssige Flüssigkeit auf der Probe, fügen Sie dem Gewebe eine geeignete Bruchflüssigkeit (0,1% Triton x-100 in 0,1% igem Natriumcitrat) hinzu, wobei das Gewebe vollständig infiltriert wird, und behandeln Sie sie bei Raumtemperatur für 20 Minuten; Nachdem die Bruchbehandlung abgeschlossen ist, wird die Probe jedes Mal 5 Minuten lang mit PBS-Lösung gespült; Die behandelte Probe befindet sich in einer feuchten Box, um die Probe feucht zu halten.

B. Tissue Tiefkühlabschnitt

1. Tauchen Sie die Folien in 4% paraformaldehyd-Lösung (gelöst in PBS) zur Fixierung und inkubieren Sie 10-15 min bei Raumtemperatur;

2. Nachdem der Film aus dem Fixativ genommen wird, lassen Sie ihn natürlich in einer Abzugshaube trocknen;

3. Spülen Sie die Folien in reinem Wasser oder PBS, um die auf den Folien verbleibende Fixierlösung zu entfernen.

4. Ziehen Sie einen histochemischen Stift, um einen kleinen Kreis 2-3 mm von dem Gewebe entlang des Umfangs des Gewebes zu zeichnen, um die nachgeschalteten Permeabilitätsabwicklungs- und Gleichgewichtsvorgänge zu erleichtern; Lassen Sie das Probe während des Experiments nicht trocken, und die verarbeitete Probe hält die Probe feucht in einer feuchten Box.

5. Bereiten Sie die Proteinase-K-Arbeitslösung vor: Verdünne Proteinase K (200 μg / ml) mit PBS als das Verdünnungsmittel in einem Verhältnis von 1: 9, um die Endkonzentration von 20 μg / ml herzustellen;

6 Fügen Sie zu jeder Probe 100 μl der oben genannten Proteinase-K-Arbeitslösung, so dass es vollständig bedeckt ist, und inkubieren Sie 10 min bei Raumtemperatur;

(Hinweis: Die Behandlung von Proteinase K hilft hauptsächlich den Geweben und den Zellen, die Färbungsreagenzien in den nachfolgenden Schritten zu durchdringen. Wenn die Inkubationszeit zu lang oder zu kurz ist, wirkt sich die anschließende Kennzeichnungseffizienz aus. Wenn keine besseren Ergebnisse erzielt werden, wird die Inkubation erhalten Zeit der Proteinase K muss optimiert werden)

7. Spülen Sie die Probe 2-3-mal mit PBS-Lösung, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen (Proteinase K muss sauber gewaschen werden, andernfalls stört die anschließende Kennzeichnungsreaktion) und platzieren Sie die verarbeitete Probe in einem feuchten Kasten, um die Probe feucht zu halten ;

(Optionaler Schritt) Fügen Sie eine geeignete Menge an Bruchlösung (0,1% Triton X-100 in 0,1% igem Natriumcitrat) auf das Gewebe hinzu, vollständig infiltrieren Sie das Gewebe, und behandeln Sie es 20 Minuten bei Raumtemperatur. Gleiches gilt, nachdem die Bruchbehandlung abgeschlossen ist. Spülen Sie die Probe mit PBS-Lösung, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen, und legen Sie die verarbeitete Probe in eine feuchte Box, um die Probe feucht zu halten.

C. Zellklettern

1. Kultivieren Sie anhaftende Zellen auf den Rutschen des Labor-Tek-Kammers. Nach der Apoptose-Induktionsbehandlung spülen Sie die Folien vorsichtig zweimal mit PBS;

2. Fügen Sie eine geeignete Menge von 4% Paraformaldehyd-Lösung (in PBS) zu jeder Gleitkammer zur Fixierung und inkubieren Sie 20 min bei Raumtemperatur;

3. Entfernen Sie das Fixiermittel, fügen Sie PBS und waschen Sie das 3-mal, 5 min jedes Mal;

Jede Probe wird in 0,2% Triton X-100-Lösung eingetaucht, die in PBS hergestellt wurde, und inkubiert 5 min bei Raumtemperatur zur Permeabilisierung;

5. Tauchen und reinigen Sie die Probe 2-3-mal in einem mit PBS-Lösung gefüllten offenen Becherglas;

6. Entfernen Sie die überschüssige Flüssigkeit sanft und löschen Sie die Flüssigkeit vorsichtig um die Probe auf dem Schlitten mit Filterpapier. Die verarbeitete Probe befindet sich in einer feuchten Box, um die Probe feucht zu halten.

D. Zellenabstrich.

1. resuspendieren Sie die Zellen in PBS in einer Konzentration von etwa 2 × 107 Zellen / ml, Pipette 50-100 μl Zellsuspension auf den Anti-Drop-Glasrutschen, und verwenden Sie einen Reinglasser, um die Zellsuspension sanft zu verteilen;

2. Tauchen Sie die Folien in ein Färbenglas, das 4% frisch zubereitete Paraformaldehyd in PBS enthält, die Zellen fixieren und 25 min bei 4 ° C platzieren;

3. Tauchen Sie den Objektträger in PBS, lassen Sie es 5 Minuten bei Raumtemperatur und wiederholen Sie dann einmal;

4. Entfernen Sie die überschüssige Flüssigkeit sanft und löschen Sie die überschüssige Flüssigkeit vorsichtig um die Probe auf dem Schlitten mit Filterpapier. Verwenden Sie einen histochemischen Stift, um einen kleinen Kreis entlang des Umfangs der Zelle zu zeichnen, um die nachgeschaltete Permeabilitätsabwicklung und das Bilanzmarkierungsvorgang zu erleichtern. Lassen Sie das Probe während des Experiments nicht trocken;

Jede Probe wird in 0,2% Triton X-100-Lösung eingetaucht, die in PBS hergestellt wurde, und inkubiert 5 Minuten bei Raumtemperatur für die Permeabilisierung;

6. Tauchen und reinigen Sie die Probe 2-3-mal in einem mit PBS-Lösung gefüllten offenen Becherglas;

6. Entfernen Sie sanft überschüssige Flüssigkeit, und verwenden Sie Filterpapier, um die Flüssigkeit vorsichtig um die Probe auf dem Schlitten aufzunehmen. Die verarbeitete Probe befindet sich in einer feuchten Box, um die Probe feucht zu halten.

II. DNase i Behandlung Positives Steuerungsexperiment (optionaler Schritt)

Nachdem die Probe permeabilisiert ist, behandeln Sie die Probe mit DNase I (G3342 empfohlen), um eine positive Steuerung vorzubereiten.

1. Fügen Sie 100 μl 1 × DNase I-Puffer (Herstellungsverfahren: 10 μl 10 × DNase I-Puffer hinzu, dann fügen Sie dann tropfenweise 90 μl entionisiertes Wasser zu mischen) tropfenweise auf die durchdringete Probe und inkubieren Sie 5 min bei Raumtemperatur;

2. Entfernen Sie sanft überschüssige Flüssigkeit und geben Sie 100 μl Arbeitslösung, die DNase I (20 U / ml) enthält ), bei Raumtemperatur 10 min inkubieren;

3. Entfernen Sie sanft überschüssige Flüssigkeit und waschen Sie die Folien 3-4 mal in einem mit PBS gefüllten Färbenglas.

(Hinweis: Für die positiven Kontrollfolien muss ein separater Färbebehälter verwendet werden, andernfalls können die restliche DNase I auf den positiven Kontrollrutschen einen hohen Hintergrund auf den experimentellen Rutschen einführen)

III. Markierung und Prüfung.

1. Äquilibrierung: Fügen Sie 50 μl-Äquilibrierungspuffer an jede Probe hinzu, um den zu testenden Probenbereich abzudecken, und inkubieren Sie 10 min bei Raumtemperatur;

2. Vorbereitung der Etikettierungslösung: THAW-TMR-5-DUTP-Kennzeichnungsmix und Equilibrierungspuffer auf Eis, und folgen rekombinantes TDT-Enzym: TMR-5-DUTP-Etikettierungsmix: Equilibrationspuffer = 1 μl: 5 μl: 50 μl (1: 5 : 50) Mischen Sie den TDT-Inkubationspuffer, der für alle Experimente ausreicht. Das Volumen der Reagenzien, die in bestimmten Experimenten verwendet werden, kann in einem geeigneten Anteil entsprechend der Größe des Schiebers eingestellt werden;

3. Negatives Steuerungssystem: Bereiten Sie einen Steuerungspuffer des TDT-Inkubationspuffers ohne rekombinantes TDT-Enzym vor und ersetzen Sie es mit DDH2O;

4. Kennzeichnung: Versuchen Sie, den ausgeglichenen Gleichgewichtspuffer zu entfernen, und fügen Sie dann 56 μl TDT-Inkubationspuffer zu jeder Gewebeprobe hinzu und inkubieren Sie 1 h bei 37 ° C; Achten Sie darauf, die Folien nicht zu trocknen, und die Folien sollten vor Licht geschützt werden;

5. Spülen Sie die Gewebeprobe sofort mit PBS für das 4-fache, 5 min jedes Mal;

6. Wischen Sie die PBS-Lösung vorsichtig um die Probe mit Filterpapier ab.

7. Kernfärbung: Die Probe wird im Färbungsbehälter befleckt, und der Schieber wird in den Färbenbehälter eingetaucht, der die DAPI-Lösung (frisch hergestellte und mit PBS) in der Dunkelheit enthält, und 8 Minuten lang bei Raumtemperatur linke;

8. Montieren des Objektträgers: Nachdem die Probe gefärbt ist, waschen Sie die Gewebeprobe dreimal mit PBS für jeweils 5 Minuten lang und entfernen Sie dann sanft die überschüssige Flüssigkeit und fügen Sie tropfenweise Anti-Fluoreszenz-Abschreck-Montagetabletten (empfohlen G1401) hinzu, um die Folie zu montieren ;

7. Mikroskopische Untersuchung: Analysieren Sie die Probe sofort unter einem Fluoreszenzmikroskop. Die Folie sollte vor Licht geschützt werden. DAPI kann sowohl apoptotische als auch nicht apoptotische Zellen blau färben, und TMR-5- ist nur im apoptotischen Kern vorhanden. Rote Fluoreszenz lokalisiert durch dUTP-Einbau.

NS. Verwenden Sie die Fließzytometrie, um Suspensionszellen zu erkennen

1. Waschen Sie die zu testenden Zellen zweimal mit PBS, Zentrifugen bei 4 ° C (500 g) und resuspendieren in 500 μl PBS;

2. Fixierung: Fügen Sie 5 ml 1% Paraformaldehyd-Lösung hinzu, die mit PBS an die Probe hergestellt werden, fixieren Sie die Zellen und setzen Sie 20 Minuten auf Eis;

3. Zentrifugieren der Zellen bei 300 g für 10 min bei 4 ° C, entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie sie zweimal in 5 ml PBS und resuspendieren Sie die Zellen schließlich in 500 μl PBS;

4. Permeabilisierung: Fügen Sie 5 ml 70% Ethanol hinzu, das auf Eis an der Probe vorgekühlt ist, und inkubieren Sie 4 Stunden bei -20 ° C, um die Zellen zu durchdringen;

(Hinweis: Die Zellen können auch mit 0,2% Triton X-100 in PBS-Lösung bei Raumtemperatur 5 Minuten permeabilisiert werden).

Nach Zentrifugation bei 300 g für 10 min wurden die Zellen in 5 ml PBS resuspendiert und nach Zentrifugation in 1 ml PBS resuspendiert;

6. Äquilibrierung: Übertragen von etwa 2 × 106-Zellen mit einem 1,5 ml-Mikrozentrifugenröhrchen, Zentrifugen mit 300 g für 10 Minuten, entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie in 80 μl Equilibrationspuffer und inkubieren Sie 5 min bei Raumtemperatur;

7. Vorbereitung der Etikettierungslösung: THAW-TMR-5-DUTP-Kennzeichnungsmischung und Equilibrationspuffer auf Eis, und folgen Rekombinant-TDT-Enzym: TMR-5-DUTP-Etikettierungsmix: Equilibrationspuffer = 1 μl: 5 μl: 50 μl (1: 5 : 50) Mischen Sie den TDT-Inkubationspuffer, der für alle Experimente und optionalen positiven Steuerungsreaktionen ausreicht;

8. Kennzeichnung: Die Zellen wurden 10 min bei 300 g zentrifugiert, der Überstand wurde entfernt, und das Pellet wurde in 56 μl TDT-Inkubationspuffer resuspendiert und 1 h bei 37 ° C für 1 h inkubiert und vor Licht geschützt. Die Zellen sanft mit einer Mikropipette alle 15 Minuten resuspendieren;

9. Fügen Sie nach Abschluss der Reaktion 1 ml 20 mM EDTA hinzu, um die Reaktion zu stoppen, und mischen Sie sanft mit einer Mikropipette;

10. Zentrifugieren bei 300 g 10 min, entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 1 ml 0,1% Triton X-100-Lösung, die mit PBS hergestellt wurden, der 5 mg / ml BSA enthält und zweimal waschen;

11. Kernfärbung: Zentrifugen bei 300 g 10 Minuten, entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 0,5 ml DAPI-Lösung, das 250 μg dnase-freie RNase A enthält, die die Zellen 30 min bei Raumtemperatur in der Dunkelheit inkubieren;

12. Bordkennung: Durchflusszytometrieanalyse von Zellen, Dapi kann sowohl apoptotische als auch nicht-apoptotische Kerne in Blau färben, und nur in den apoptotischen Kernen kann es TMR-5-DUTP-Einbau und lokalisierte rote Fluoreszenz geben.

V. experimenteller Prozessdiagramm

G1502-50TB.G1502-50TC.G1502-50TD.

Aufmerksamkeit:

Dieses Produkt ist nur für wissenschaftliche Forschungszwecke, nicht für die klinische Diagnose!

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