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Anteil an:

Tsaplus-Fluoreszenz-Doppelfärbung-Kit für doppelte Immunfluoreszenzfärbung von Paraffinabschnitten

Spezifikation: 50t.
Verfügbarkeitsstatus:
  • G1226-50T.
  • Servicebio

Produktbeschreibung

Tsaplus-Fluoreszenz-Doppelfärbungsset

Katze-Nr. G1226-50T.

Packungsinhalt:

Produkt Artikel-Nr.

Produktname

Spezifikation

Tsaplus-Fluoreszenz Triple Fleckenkit

G1226-50T.

50t.

G1226-100T.

100t Jahre

Produkteinführung:

Dieses Produkt-Tsaplus-Fluoreszenz-Doppelfärbungsset eignet sich für die doppelte Immunfluoreszenz-Doppelfärbung von Paraffinabschnitten, insbesondere zum doppelten fluoreszierenden Immunolabel von primären Antikörpern aus derselben Quelle und kann auch zum doppelten fluoreszierenden Immunolabel von Antikörpern aus verschiedenen Quellen verwendet werden. Das Hauptprinzip basiert auf der Tyramidsignalverstärkung (TSA, Tyramidsignalamplifikation), nachstehend als TSA-Technologie bezeichnet. Das Hauptprinzip der TSA-Technologie besteht darin, die Peroxidase-Reaktion von Tyramid (d. H. Das fluoreszent markierte Tyramidsalz bildet, bildet eine kovalente Bindungsbindungsstelle unter HRP, die von H2O2 katalysiert ist), um eine große Anzahl von enzymatischen Reaktionen zu erzeugen. Dieses Produkt kann mit den umgebenden Proteinrückständen (einschließlich Tryptophan, Histidin und Tyrosinrückstände) interagieren, um eine große Menge an Fluorescein-Abscheidung an der Antigen-Antikörper-Bindungsstelle zu bilden, um die Signalverstärkung zu erreichen. Sie können auch verschiedene fluoreszierende Tyramine verwenden, um mehrere fluoreszierende Färbung durch Wiederholen des Immunolabels mehrmals zu erreichen. Verglichen mit dem anderen TSA-Fluoreszenz-Doppelfärbungskit des Unternehmens G1235 verwendet dieses Kit IF488-Tyramid und IF555-Tyramid mit stärkeren und stabileren Fluoreszenzsignalen anstelle von Fitc-Tyramid und Cy3-Tyramid, das eine aktualisierte Version von G1235 ist.

Die Fluoreszenzspektrumdaten der relevanten fluoreszierenden Farbstoffe der TSA-Serie fluoreszierende Färbungskits sind wie folgt:

Fluoreszenzfarbstofftyp.

Ex / em.

FITC-TYRAMIDE.

492/518.

CY3-TYRAMIDE.

555/569.

IF488-TYRAMIDE.

491/516.

IF555-TYRAMIDE.

557/570.

if647-Tyramide.

656/670.

Lagerbedingungen:

EIR Packs Transportation, Laden bei -20 ° C, gültiger Zeitraum beträgt 12 Monate.

Komposition

Komponentennummer

Komponente

G1226-50T.

G1226-100T.

Lagerung

G1226-1.

IF488-TYRAMIDE.

25 μl.

2 × 25 μl

-20 ℃.

G1226-2.

IF555-TYRAMIDE.

25 μl.

2 × 25 μl

-20 ℃.

G1226-3.

Tyramidverdünnungsmittel.

50 ml.

50 ml.

4 ℃.

G1226-4.

Dapi (bereit zu bedienen)

10 ml.

20 ml.

4 ℃.

G1226-5.

Tissue AutofluorScence Quencher Eine Lösung

10 ml.

20 ml

Zimmertemperatur

G1226-6.

Tissue AutofluorScence Quencher B Lösung

10 ml.

20 ml

Zimmertemperatur

G1226-7.

Anti-Fluoreszenz-Quencher

5 ml.

10 ml.

-20 ℃.

Vorbereitung vor dem Experiment:

1. 0,01 Mol / l PBS-Puffer (PH7.0-7.4, empfohlen G4202 oder G0002), 3% H2O2 und 0,3% H2O2 herstellen;

2. Bereiten Sie den primären Antikörper und den entsprechenden HRP-markierten sekundären Antikörper, der Antigen-Retrieval-Lösung (wählen Sie die entsprechende Antigen-Retrieval-Lösung gemäß der Art von Antikörper und Gewebe);

3. Bereiten Sie gemäß der Dosierung die TSA-Färben-Arbeitslösung gemäß dem folgenden Verhältnis vor.

TSA-Färbung-Arbeitslösung

Reagenz-Artikel

Volumen

TSA-488-Färbungslösung

Tyramidverdünnungsmittel.

1 ml

0,3% H2O2.

10 μl.

IF488-TYRAMIDE.

2 μl.

TSA-555-Färbungslösung

Tyramidverdünnungsmittel.

1 ml

0,3% H2O2.

10 μl.

IF555-TYRAMIDE.

2 μl.

HINWEIS: Nachdem das fluoreszierende Tyramid geschmolzen ist, zentrifugieren Sie es für kurze Zeit und nehmen Sie sie dann nach dem Mischen mit sauberen Pipettenspitzen ein. Die TSA-Färbe-Arbeitslösung wird empfohlen, um sofort zu nutzen. Es sollte bei 4 ° C gelagert werden und vor Licht geschützt werden, und es ist innerhalb von 24 Stunden wirksam.

Schritte

Gewebefolien nimmt als Beispiel, das Wasser in den folgenden experimentellen Schritten ist reines Wasser.

1. Deparaffinisieren Sie Gewebeabschnitte zum Wasser;

2. Antigenabruft: Gemäß dem verwendeten primären Antikörper und der Art der Probe verwenden Sie ein geeignetes Verfahren, um das Antigenabruf auf dem Gewebeabschnitt durchzuführen.

3. 3 mal mit PBS, 5 min bei jeder Zeit waschen, verwenden Sie einen Pap-Stift, um das Gewebe zu kreisen und zu markieren.

4. Fügen Sie 100 μl Gewebe-Autofluoreszenz-Quencher eine Lösung tropfenweise auf das Gewebe hinzu, inkubieren Sie 30 Minuten bei Raumtemperatur und waschen Sie 5 min;

5. Inaktivieren von endogenem Peroxidase: 3% H2O2 in den Abschnitt hinzufügen, um das Gewebe abzudecken, und inkubieren Sie 25 Minuten lang bei Raumtemperatur in der Dunkelheit, um endogene Peroxidase zu blockieren, um eine nichtspezifische Hintergrundfärbung zu reduzieren. 3 mal mit 1 × PBS, 5 min jedes Mal waschen;

6. Block: Nachdem die Objektträger leicht getrocknet sind, werden 30 Minuten lang 3% BSA oder Serum zugetropft, um 30 Minuten abzudichten. Das Blockierreagenz wird gemäß der Spezies des primären Antikörpers und des sekundären Antikörpers bestimmt;

7. Inkubieren Sie den primären Antikörper: Verdünnen Sie den primären Antikörper auf eine geeignete Konzentration mit 1 × PBS oder Blockierlösung (G2010 wird empfohlen). Schütteln Sie die Blockierlösung sanft auf dem Abschnitt ab, fügen Sie den verdünnten Primärantikörper tropfenweise zu, um das Gewebe abzudecken, und legen Sie den Abschnitt flach in eine feuchte Kammerbox mit Wasser und inkubieren Sie über Nacht bei 4 ° C. 3 mal mit 1 × PBS, 5 min jedes Mal waschen;

8. Inkubieren Sie den hrp-markierten sekundären Antikörper: Verdünnen Sie den sekundären Antikörper auf eine geeignete Konzentration mit 1 × PBS- oder Blockierlösung (G2010 wird empfohlen), fügen Sie den sekundären Antikörper tropfenweise dem Gewebe hinzu, und inkubieren Sie 50 Minuten bei Raumtemperatur. 3 mal mit 1 × PBS, 5 min jedes Mal waschen;

9. Fügen Sie 50-100 μl TSA-488-Färben-Arbeitslösung auf das Gewebe hinzu, um sicherzustellen, dass das Gewebe vollständig abgedeckt ist, und inkubieren Sie 10 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln. Waschen Sie mit 1 × PBS 3-mal, 5 min jedes Mal;

10. Mikrowellenbehandlung: Der Gewebeabschnitt befindet sich in einem mit Antigen-Abruflösung gefüllten Reparaturkasten (wählen Sie die entsprechende Antigen-Retrieval-Lösung gemäß dem Gewebtyp und Antikörper) zur Mikrowellenheizungsbehandlung zur Entfernung der gebundenen primären und sekundären Antikörper. In diesem Schritt ist es notwendig, trockene Flocken zu verhindern, die durch übermäßige Flüssigkeitsverdampfung verursacht werden.

11. Wiederholungsschritt 7, um den zweiten primären Antikörper inkubieren: Verdünnen Sie den zweiten Antikörper (primärer Antikörper), der mit PBS (oder einem anderen Antikörperverdünnungsmittel) zu einer geeigneten Konzentration getestet wird. Schütteln Sie die Flüssigkeit sanft auf dem Abschnitt ab, fügen Sie den verdünnten Antikörper tropfenweise, um das Gewebe abzudecken, und legen Sie den Abschnitt flach in einem befeuchteten Kasten mit Wasser und inkubieren Sie über Nacht bei 4 ° C. Mit PBS 3-mal waschen, 5 Minuten jedes Mal;

12. Wiederholungsschritt 8, um den entsprechenden HRP-Sekundärantikörper zu inkubieren: Verdünnen Sie den sekundären Antikörper auf eine geeignete Konzentration mit PBS (oder einem anderen Antikörperverdünnungsmittel), fügen Sie den sekundären Antikörper tropfenweise dem Gewebe hinzu, und inkubieren Sie 50 Minuten bei Raumtemperatur. Mit PBS 3-mal waschen, 5 Minuten jedes Mal;

13. Fügen Sie 50-100 μl TSA-555-Färbefärbungslösung auf das Gewebe hinzu, um sicherzustellen, dass das Gewebe vollständig abgedeckt ist, und 10 Minuten bei Raumtemperatur in der Dunkelheit inkubieren. Mit PBS 3-mal waschen, 5 Minuten jedes Mal;

14. NUKLUS ZUM BEREITUNG MIT DAPI: Nachdem die Abschnitte leicht getrocknet sind, fügen Sie dem Gewebe Dapi (gebrauchsfertige) Färbungslösung hinzu, und inkubieren Sie 10 Minuten bei Raumtemperatur in der Dunkelheit. Mit PBS 3-mal waschen, 5 Minuten jedes Mal;

15. Gewebeautofluoreszenzlöschung: Gewebe-Autofluoreszenz-Quencher B-Lösung tropfenweise auf das Gewebe hinzufügen, 5 min bei Raumtemperatur inkubieren und 3 min mit fließendem Wasser spülen;

16.Mounting und mikroskopische Untersuchung: Nachdem die Abschnitte leicht getrocknet sind, fügen Sie den Fluoreszenzlaser, um die Folien zu montieren. Beobachten und sammeln Sie Bilder mit einem Fluoreszenzmikroskop oder einem konfokalen Lasermikroskop. Die Scheiben können 15 Tage bei 4 ° C in einer lichtdurchsichtigen Slide-Box gelagert werden.

Vorsichtsmaßnahmen

1. Verglichen mit fluoreszierendem sekundären Antikörper weist das TSA-Kit eine höhere Empfindlichkeit und ein stärkeres Signal auf. Daher muss die Konzentration des primären Antikörpers verringert werden, im Allgemeinen um 5-10-mal auf der Grundlage des in der Antikörperhandbuchs empfohlenen Verdünnungsverhältnissen, um die durch nichtspezifische Bindung verursachte Hintergrundfluoreszenz zu reduzieren. Es wird empfohlen, die Gradientenkonzentration des primären Antikörpers einzustellen, um den besten Effekt zu erhalten.

2. Wenn die Hintergrundfluoreszenz stark ist, wird empfohlen, den Abschreckschritt von Gewebeautoofluoreszenz hinzuzufügen.

Das empfohlene Verdünnungsverhältnis von fluoreszierendem Tyramid beträgt 1: 500, und das Verdünnungsverhältnis kann entsprechend den experimentellen Ergebnissen eingestellt werden (der empfohlene Verdünnungsverhältnisbereich beträgt 1: 200-1: 1000).

4. Für mehrere fluoreszierende Kennzeichnungen wird empfohlen, den polyklonalen Antikörper zuerst inkubieren, dann den monoklonalen Antikörper inkubieren; Inkubieren Sie den Antikörper, der dem Target-Target-Protein mit niedrigem Fülle entspricht, zuerst, und inkubieren Sie dann den Antikörper, der dem Target-Protein mit hoher Fülle entspricht.

G1226-50TB.Reagenz -1 (1)downloadimg.Scheibe 13.Scheibe 12.Scheibe 10

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